1.本发明涉及植物的休眠芽破眠技术领域，具体涉及一种促进华重楼根状茎芽快速萌发出苗的方法。
背景技术：
2.华重楼(parispolyphylla smith var.chinensis(franch.)hara.)是百合科重楼属多年生草本植物，又名七叶一枝花、蚤休、独叶一枝花等，最早在神农本草经里以蚤休之名记载，为2020年版《中国药典》收载的二基原药材“重楼”的来源之一。华重楼以干燥根茎入药，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效。现代药理学研究表明，华重楼还具有抗癌止血、祛痰抑菌、止咳平喘、镇静镇痛、抗早孕杀灭精子和抗细胞毒等作用。近年来研究发现华重楼对亚洲a型流感病毒有抑制作用。新型冠状病毒sars-cov-2主要通过其s蛋白与人体细胞表面的angiotensin-converting enzyme 2(ace2)受体结合，利用分子对接法模拟预测了华重楼中富含的3种重楼皂苷(i、vi、vii)与ace2的结合亲和力，结果表明基于这三种有效成分进行结构设计有望获得高效的sars-cov-2抑制剂。随着华重楼研究的深入，应用范围不断拓展，市场需求量大增，消耗量远超其野生资源生长量，在主产地区还出现了滥采乱挖的现象，导致其野生资源日渐枯竭。
3.在人工栽培华重楼的过程中，发现华重楼根状茎芽与种子一样，存在休眠现象。在秋冬季节华重楼地上部分倒苗后，芽要经过一段时间的生长停滞期，期间即使给予适宜的环境条件也不能诱导芽的萌发，必须经过冬季积累一定低温至第二年春初才能萌发出苗。结合lang等(1987)对芽休眠的分类标准，华重楼的生长符合champagnat(1989)对多年生植物年周期的划分，秋冬季节华重楼倒苗后根状茎芽需经历一段时间的内休眠时期，休眠期通常为3～4个月。在使用根状茎切块繁殖时常由于休眠机制的存在导致根状茎芽无法及时启动生长而腐烂凋亡；同时华重楼芽休眠还增加了根状茎保藏、管护的成本，也延长了华重楼的成药周期。综上可知，随着温室大棚技术在华重楼人工栽培中的应用，芽休眠可能成为新形势下华重楼产业发展的桎梏。目前尚无华重楼根状茎芽休眠破除的研究。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种促进华重楼根状茎芽快速萌发出苗的方法。本发明所述方法操作简单，效果稳定，能够达到快速诱导华重楼休眠根状茎芽萌发出苗的目的。
5.本发明提供了一种促进华重楼根状茎芽快速萌发出苗的方法，包括以下步骤：
6.1)将华重楼根状茎芽在0～15℃进行低温处理10～40d，得到低温处理的休眠芽；
7.2)将步骤1)得到的低温处理的休眠芽置于50～200mg
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的赤霉素水溶液中浸泡4～10h，得到赤霉素处理的休眠芽；
8.3)将步骤2)得到的赤霉素处理的休眠芽进行沙藏，每10d施加一次2～20mg
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的胺鲜酯水溶液，实现华重楼根状茎芽的快速萌发。
9.优选的是，步骤1)所述低温处理前，还包括对华重楼根状茎芽进行清洗、消毒、包
装的操作；所述消毒包括用多菌灵进行浸泡；所述包装包括用打孔薄膜进行包装。
10.优选的是，所述步骤1)中，低温处理的温度为5～10℃，时间为20～30d。
11.优选的是，所述步骤2)中，赤霉素水溶液中赤霉素的质量浓度为100～150mg
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，所述浸泡的时间为6～8h。
12.优选的是，所述步骤2)中，所述浸泡的温度为20℃。
13.优选的是，步骤3)所述沙藏，保持华重楼根状茎芽的芽露出沙面1.0cm。
14.优选的是，步骤3)所述沙藏，保持沙子湿润，空气流通，避免阳光直射。
15.优选的是，所述步骤3)中，胺鲜酯水溶液中胺鲜酯的质量浓度为5～10mg
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。
16.优选的是，步骤3)所述沙藏的温度为18～22℃。
17.优选的是，步骤3)所述沙藏，保持光照强度为3800lx，光周期为7～12h
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。
18.本发明提供了一种促进华重楼根状茎芽快速萌发出苗的方法。本发明以自然倒苗后进入休眠的华重楼根状茎芽为材料，经过低温和赤霉素处理后，置于适宜环境沙藏，通过定期淋施胺鲜酯，可以达到快速诱导华重楼根状茎芽出苗的目的。出苗后结合温室大棚技术，可以增加华重楼地上部分的生长时间，加快根茎有效成份及生物量的积累，缩短华重楼的成药时间，对华重楼产业的发展具有重要的意义。本发明操作简单，具有芽出苗快、诱导效果稳定等特点，可以为华重楼设施栽培新模式-无休眠栽培的实现提供技术参考。试验结果表明，利用本发明方法，芽出苗时间比未处理根状茎芽提前10～50d，出苗后芽与根茎生长良好，可以正常完成其生命周期，本发明的破眠效果稳定，出苗率高。
具体实施方式
19.本发明提供了一种促进华重楼根状茎芽快速萌发出苗的方法，包括以下步骤：
20.1)将华重楼根状茎芽在0～15℃进行低温处理10～40d，得到低温处理的休眠芽；
21.2)将步骤1)得到的低温处理的休眠芽置于50～200mg
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的赤霉素水溶液中浸泡4～10h，得到赤霉素处理的休眠芽；
22.3)将步骤2)得到的赤霉素处理的休眠芽进行沙藏，每10d施加一次2～20mg
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的胺鲜酯水溶液，实现华重楼根状茎芽的快速萌发。
23.本发明将华重楼根状茎芽在0～15℃进行低温处理10～40d，得到低温处理的休眠芽。本发明优选选取健康、无病害的华重楼根状茎芽。在本发明中，所述低温处理前，优选还包括对华重楼根状茎芽进行清洗、消毒、包装的操作；所述消毒包括用多菌灵进行浸泡；所述包装包括用打孔薄膜进行包装。本发明对所述清洗的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规清洗方法即可。在本发明中，所述消毒优选使用质量百分含量为0.1％多菌灵进行浸泡，所述浸泡的时间优选为30～60min，更优选为30min。消毒后，本发明进行包装，本发明优选使用塑料薄膜进行包装，所述塑料薄膜优选进行打孔，以便通气。在本发明中，所述薄膜的打孔的密度优选为12个/m2。包装后，本发明优选以事先已消毒好的湿润细沙做填充物，将包装好的根状茎芽置于低温条件下恒温处理，即进行低温处理。在本发明中，低温处理的温度更优选为5～10℃，最优选为5℃，时间更优选为20～30d，最优选为25d。本发明优选控制温度精度为
±
0.5℃。本发明所述低温处理条件的设定，能够满足华重楼根状茎芽解除休眠所述的最低需冷量。目前尚未有华重楼根状茎芽休眠解除、促进休眠芽提早出苗的方法，通过本发明的低温处理方法，可以快速达到本发明促进芽出苗所需的最低
需冷量。
24.得到低温处理的休眠芽后，本发明将低温处理的休眠芽置于50～200mg
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的赤霉素水溶液中浸泡4～10h，得到赤霉素处理的休眠芽。本发明取出低温处理的休眠芽后，优选先去除坏死或芽生长不良的根茎。在本发明中，赤霉素水溶液中赤霉素的质量浓度更优选为100～150mg
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，最优选为100mg
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，所述浸泡的时间更优选为6～8h，最优选为8h。在本发明中，所述浸泡的温度优选为20℃。本发明在低温处理华重楼休眠根状茎芽后使用适宜条件的赤霉素处理，可以促进芽的萌发出苗。
25.得到赤霉素处理的休眠芽后，本发明将赤霉素处理的休眠芽进行沙藏，每10d施加一次2～20mg
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的胺鲜酯水溶液，实现华重楼根状茎芽的快速萌发。本发明优选将赤霉素处理的休眠芽转移至育苗室中进行沙藏。在本发明中，所述沙藏，优选保持华重楼根状茎芽的芽露出沙面1.0cm。在本发明中，所述沙藏，优选保持沙子湿润，空气流通，避免阳光直射。本发明优选定期浇水，保持沙子湿润，更优选保持沙子的湿度在30％～40％(用手抓一把沙子紧握成团，松开即散为宜)。本发明施加胺鲜酯的方式优选为淋施。在本发明中，胺鲜酯水溶液中胺鲜酯的质量浓度更优选为5～10mg
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，最优选为8mg
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。在本发明中，所述沙藏的温度优选为18～22℃，更优选为20℃。在本发明中，所述沙藏，优选保持光照强度为3800lx，光周期优选为7～12h
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，更优选为8h
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。培养一段时间后可以观测到芽萌发出苗，出苗时间比未处理根状茎芽提前10～50d。本发明将经低温处理、赤霉素处理的芽在上述特定条件下进行沙藏，定期淋施适宜浓度的胺鲜酯，可以起到快速诱导芽出苗的作用。本发明将根状茎芽置于育苗室内进行沙藏处理，可以避免霜冻的伤害，沙藏时可将芽微露出沙面，使芽能较好感受光照，再经适宜浓度的胺鲜酯处理，可加快芽内光合色素的积累，提高过氧化物酶及硝酸还原酶的活性，促进植株的碳、氮代谢，增强植株对水肥的吸收和干物质的积累，调节体内自由水与束缚水的比例，促进芽休眠的解除进程，最终诱导芽提早出苗。使用本发明的沙藏和处理方法，可使出苗时间提前10～50d，缩短了贮藏时间，增加了光合作用周期。
26.华重楼芽破眠的方法至今尚未见报道。本发明所用华重楼通常在12月初倒苗，来年二月底至三月初出苗，休眠期约为90～100d。在本发明中，经低温、赤霉素及沙藏、胺鲜酯处理的华重楼根状茎芽，出苗时间比未处理的芽提前10～50d，最快在一月底可以观测到出苗。未处理芽是指自然倒苗后移至温度20
±
2℃育苗室中、不经低温、赤霉素和胺鲜酯处理、按常规管理方法沙藏的休眠芽，仅定期浇水，保持沙子湿润。芽提前出苗，既能增加地上部分的生长周期，又由于在温暖潮湿天气到来之前植株已转入旺盛生长期，此时植株抵抗病害能力强，可减少因病害发生造成的死苗危机，对华重楼的生长发育和产业化发展有着重要的意义。目前华重楼根状茎诱导多芽的技术已有一定突破，使得根状茎诱导多芽成为可能，然而诱导出的侧芽同样存在内休眠现象，本发明的技术方法可以为今后华重楼设施栽培的新模式-无休眠栽培的实现提供技术基础。
27.下面结合具体实施例对本发明所述的一种促进华重楼根状茎芽快速萌发出苗的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
28.实施例1
29.1)低温处理休眠芽：选取健康、无病害的华重楼根状茎芽，将其清洗干净，然后用0.1％多菌灵浸泡30min进行消毒，再用塑料薄膜包装，塑料薄膜按12个/m2打孔，以便通气。
用事先已消毒好的湿润细沙作填充物，然后将包装好的根状茎芽置于5℃恒温处理25d，温度精度为
±
0.5；
30.2)赤霉素处理休眠芽：取出低温处理的根状茎芽，去除坏死或芽生长不良的根茎，将根状茎芽于100mg
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赤霉素水溶液中浸泡8h；
31.3)休眠芽诱导萌发：经低温、赤霉素处理后的根状茎芽，转移至温度20
±
2℃、光周期8h
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的育苗室中沙藏，沙藏时使芽露出沙面1.0cm，定期浇水保持沙子湿润，并保持空气流通，每10d淋施一次8mg
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胺鲜酯水溶液，25d可以诱导芽出苗；本发明从低温处理开始至观测到芽出苗最快仅需50d，芽出苗率可达92％以上，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达。
32.实施例2
33.重复实施例1，不同的是：
34.将步骤1)中5℃低温处理时间修改为：20d；沙藏42d后可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间为62d，芽出苗率85％，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达；可能是低温处理时间短，需冷量未达到芽出苗的标准的原因，因此需要更长时间的沙藏时间积累。
35.实施例3
36.重复实施例1，不同的是：
37.将步骤2)中赤霉素浓度修改为：50mg
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；沙藏33d后可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间为58d，比实施例1增加了8d，芽出苗率为88％，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达；赤霉素可以部分代替低温，促进内休眠的解除，赤霉素浓度降低，可能导致低温补偿量不足，故而增加了出苗时间。
38.实施例4
39.重复实施例2，不同的是：
40.将步骤3)中胺鲜酯浓度修改为10mg
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；沙藏45d后可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间为65d，芽出苗率86％，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达；高浓度的胺鲜酯可能抑制了芽的活力，导致芽出苗率有所下降；同时也说明高浓度的胺鲜酯并不能弥补低温处理时间缩减所造成的需冷量不足的问题，因此出苗时间有所延长。
41.实施例5
42.重复实施例2，不同的是：
43.将步骤3)中光周期时间修改为12h
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；沙藏43d后可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间为63d，芽出苗率为88％，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达；日照时间增加，可能反而稍微抑制了芽休眠的破除，导致出苗时间延长。
44.实施例6
45.重复实施例2，不同的是：
46.将步骤2)中赤霉素浸泡时间修改为：10h；沙藏后47d可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间比实施例1增加了1为67d，出苗率87％，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达；表明赤霉素处理时间增加，可能影响了ga/aba的比值，或是长时间的激素浸泡不利于根状茎芽的生长，导致出苗时间延长。
47.实施例7
48.重复实施例3，不同的是：
49.将步骤1)低温处理温度修改为：10℃；沙藏37d后可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间为62d，出苗率90％，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达；可能是处理温度升高，处理时间不变，导致需冷量未达到芽出苗标准的原因，导致出苗时间有所延长。
50.实施例8
51.重复实施例3，不同的是：
52.将步骤3)中光周期修改为7h
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、胺鲜酯浓度修改为5mg
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；沙藏41d后可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间为66d，出苗率83％，出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系较发达。光照周期缩短后，出苗时间比实施例3多了8d；短日照会引起生长停止，可能是短日条件下导致植物脱落酸(aba)合成增加，ga合成减少，aba/ga比例升高时，具有诱导休眠的作用，因此出苗时间有所增加。
53.实施例9
54.重复实施例3，不同的是：
55.将步骤1)中低温处理时间修改为：30d；沙藏45d后可以诱导出苗，从低温处理至出苗所需时间为70d，出苗率75％；出苗时间比实施例3增加了12d，长时间的低温可能导致芽生长活力降低，导致出苗率有所下降。
56.对比例1
57.重复实施例1，不同的是：
58.将步骤2)中赤霉素修改为：吲哚乙酸iaa；沙藏后62d可以观测到出苗，从低温处理至出苗所需时间约为87d，与未处理芽出苗时间相差不大。可能是吲哚乙酸不能像赤霉素一样部分代替低温，导致芽萌发所需最低需冷量不能得到满足，休眠未能有效打破，造成出苗时间与未处理芽出现时间相近。
59.对比例2
60.重复实施例1，不同的是：
61.将步骤3)中胺鲜酯浓度修改为：50mg
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；沙藏后芽生长差，根系部分脱落死亡，出苗率仅为35％，出苗后茎叶细小。高浓度的胺鲜酯可能不利于根系的生长，导致根系脱落、活力下降，从而影响了对养分的吸收，芽生长差，出苗后茎叶发育不良，茎叶细小。
62.实施例10
63.1)低温处理休眠芽：选取健康、无病害的华重楼根状茎芽，将其清洗干净，然后用0.1％多菌灵浸泡60min进行消毒，再用塑料薄膜包装，塑料薄膜按12个/m2打孔，以便通气。用事先已消毒好的湿润细沙作填充物，然后将包装好的根状茎芽置于0℃恒温处理10d，温度精度为
±
0.5；
64.2)赤霉素处理休眠芽：取出低温处理的根状茎芽，去除坏死或芽生长不良的根茎，将根状茎芽于200mg
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赤霉素水溶液中浸泡4h；
65.3)休眠芽诱导萌发：赤霉素处理后的根状茎芽，转移至温度20
±
2℃、光周期12h
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的育苗室中沙藏，沙藏时芽不外露，定期浇水保持沙子湿润，并保持空气流通，每10d淋施一次2mg
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胺鲜酯水溶液，沙藏60d后可以诱导芽出苗，芽出苗率为80％，出苗后茎叶生长良好，根系细长。从低温处理至出苗所需时间约70d，比未处理组提前了20～30d，说明在本发明所设的各项处理的范围内，均能有效诱导休眠芽提前出苗；另外也说明任何一个处理条件的改变均有可能会对休眠芽的破眠产生影响，在本发明中使用实施例1的处理破眠效
果最佳，出苗时间短，出苗率高，芽出苗后生长健壮，根茎生长良好，根系发达。
66.实施例11
67.1)低温处理休眠芽：选取健康、无病害的华重楼根状茎芽，将其清洗干净，然后用0.1％多菌灵浸泡30min进行消毒，再用塑料薄膜包装，塑料薄膜按12个/m2打孔，以便通气。用事先已消毒好的湿润细沙作填充物，然后将包装好的根状茎芽置于15℃恒温处理30d，温度精度为
±
0.5；
68.2)赤霉素处理休眠芽：取出低温处理的根状茎芽，去除坏死或芽生长不良的根茎，将根状茎芽于100mg
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赤霉素水溶液中浸泡6h；
69.3)休眠芽诱导萌发：赤霉素处理后的根状茎芽，转移至温度20
±
2℃、光周期7h
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d-1
的育苗室中沙藏，沙藏时使芽露出沙面1.0cm，定期浇水保持沙子湿润，并保持空气流通，每10d淋施一次8mg
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l-1
胺鲜酯水溶液，沙藏50d后可以诱导芽出苗，芽出苗率为87％以上，出苗后生长良好。从低温处理至出苗所需时间约为80d，可能是低温处理温度较高，虽然增加了处理时间以及赤霉素浸泡，但仍需要较长的沙藏时间补足出苗所需的最低需冷量。出苗时间比未处理组提前了10～20d，说明该实施方案仍可以有效诱导休眠芽提前出苗。
70.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。