一种

一种
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法
技术领域
1.本发明涉及月见草组织培养育种技术领域，尤其是涉及一种
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法。


背景技术：

2.‘
黄花’月见草源于栽培或野化于欧洲的一个杂交种，1860年由英国传布至各国园艺栽培。中国东北、华北、华东(含台湾)、西南常见栽培，并逸为野生。
‘
黄花’月见草(学名：oenothera glazioviana mich.)是柳叶菜科月见草属植物，直立二年生至多年生草本，具粗大主根；茎高70
‑
150厘米，粗6
‑
20毫米，植株常密被曲柔毛与疏生伸展长毛，基生叶莲座状，倒披针形；茎生叶螺旋状互生，狭椭圆形至披针形。种子棱形，褐色，具棱角，各面具不整齐洼点，有约一半败育。花期5
‑
10月，果期8
‑
12月。月见草整株可提取芳香化合物
‑
芳樟醇，是香料、化妆品、肥皂日用品，种子榨油食用，是高档食用油，是集油料、观赏、药材于一身的多功能植物。
3.现有的技术中，目前，
‘
黄花’月见草的繁殖主要通过种子播种繁殖，由于
‘
黄花’月见草目前还没有形成品种，市场上的
‘
黄花’月见草多从野生挖掘改良而成，种子繁殖多存在变异，不稳定。以植物组织培养技术为基础建立微体快繁技术在植物工厂大规模繁殖种苗等方面得到普遍应用。由于组织培养通过体细胞繁殖，具有植株遗传稳定一致，繁殖效果好等优点，因此近年来在工厂化育苗中运用比较广泛。
4.本研究通过对
‘
黄花’月见草进行了微体快繁技术的研究，以期为
‘
黄花’月见草通过植物组织培养方式建立植物工厂提供技术依据。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法，该方法操作简便诱导率高，可达285％，增殖系数高，可达3.5，生根率可达100％，移栽成活率可达100％，克服了季节对种苗繁育的限制，获得的再生植株有效保留母本的优良性状，是
‘
黄花’月见草种苗繁育的有效途径。
6.本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
7.一种
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法，包括以下步骤：
8.s1：外植体的选择和处理，于当年健康的幼枝作为外植体，去除多余叶片及叶柄，切分成1
‑
2cm大小并带有节间且保留一片1/3大小叶片的茎段，利用灭菌剂进行消毒，无菌水浸洗；
9.s2：不定芽的诱导，将经过步骤s1处理的外植体，接种于诱导培养基中，光照培养4周，获得不定芽；
10.s3：增殖培养，将步骤s2中获得的外植体切成1
‑
2cm的茎段，切除多余的叶片，每个茎段带有一个节间且保留1
‑
2片叶片，接种至增殖培养基中，培养4周，获得丛生芽；
11.s4：生根培养，将步骤s3中获得丛生芽切分成单株，接种于生根培养基中，培养15
天，获得生根苗；
12.s5：炼苗、移栽，将步骤s4中的试管苗放在室温中，预处理1周后，取出生根苗，清洗掉培养基，杀菌剂浸泡30分钟，种于配制好的基质中，遮光炼苗，空气湿度保持在60
‑
70％之间，1周后置于自然光下，获得
‘
黄花’月见草再生植株。
13.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s2中，所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为1.8mg/l、naa浓度为0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6。
14.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s3中，所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为0.8mg/l、naa浓度为0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6。
15.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s4中，所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，添加iaa浓度为0.3
‑
1.0mg/l、ac浓度为1.0g/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6。
16.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s1中，选取半硬化的枝条作为所述外植体，灭菌剂为75％酒精，5％次氯酸钠，灭菌时间分别是30s和10min。
17.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s2中，将经过步骤s1处理的外植体切除部分的伤口垂直接种于培养基上。
18.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s3中，进行切段的所述外植体的株高在3
‑
5cm。
19.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s4中，进行切分的外植体的株高在4cm以上。
20.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s5中，所述炼苗、移栽过程中，预处理包括以下步骤：
21.半打开瓶盖倒入自来水；
22.放置在温室中弱光下2
‑
3天，20
‑
25℃保持瓶内有充足的自来水；
23.炼苗、移栽过程的基质中，草炭：珍珠岩：蛭石体积比＝6：1：3。
24.本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤s2、步骤s3、步骤s4中，培养条件均为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
25.综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
26.1.本发明利用
‘
黄花’月见草的幼茎作为外植体诱导不定芽，建立一套稳定的
‘
黄花’月见草植株再生体系，获得的组培苗具有母本优良性状，一年四季皆可进行种苗生产繁育工作，克服
‘
黄花’月见草因分根、扦插繁殖造成的品种退化，繁育受季节限制等的弊端，实现
‘
黄花’月见草组培苗的再生并有效进行大量繁育。
27.2.本发明以
‘
黄花’月见草当年生的幼茎作为外植体材料，诱导产生不定芽，4周后可以获得具有母本优良性状的再生植株，克服了以往通过诱导愈伤再分化植株时，后代出现变异等问题。
28.3.本发明在外植体的培育过程中，在外植体生长的不同阶段采用不同细胞分裂素6
‑
ba和生长素naa、iaa等激素浓度的配比，有利于外植体的生长发育，保障
‘
黄花’月见草试管苗的质量。
29.4.利用本发明的炼苗、移栽技术，对试管苗进行驯化，使其完全适应外部环境，移栽成活率可达100％，小苗质量好。
附图说明
30.图1为本发明的流程简图。
31.图2为本发明的
‘
黄花’月见草快繁初期图。
32.图3为本发明的
‘
黄花’月见草组培生根苗。
33.图4为本发明的
‘
黄花’月见草移栽苗。
具体实施方式
34.以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
35.实施例一：
36.参照图1，为实施例1的
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法，包括以下步骤：
37.s1、外植体的选择和处理：
38.于当年5
‑
6月份选取无病虫害的幼枝(半硬化枝条)作为外植体，去除叶片及叶柄，切成1.0
‑
2.0cm大小左右并带有节间的茎段，用洗洁精浸洗15min左右，流水冲洗2h，待用。在超净工作台上，先用75％的酒精灭菌30s，再用5％次氯酸钠灭菌10min，无菌水冲洗6遍，然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，外植体两端各切去1.0mm大小左右，待用。
39.其中，本技术方案中通过筛选高质量的无病虫害的幼枝(半硬化枝条)作为外植体，保证了种源的质量和活性，在去除叶片和叶柄后再切成多个茎段，然后再进行灭菌的操作，解决了现有技术中月见草外植体由于细菌的影响出现活性较差等问题，实用性强，便于推广。
40.在利用酒精与次氯酸钠灭菌后，再用无菌水冲洗，能够很好的将残留在茎段上的酒精与次氯酸钠冲洗干净，避免后期对不定芽诱导的影响，提高了植物生长的稳定性。
41.s2、不定芽的诱导：
42.将经过处理的外植体，垂直接种于诱导培养基中(分清植物学上下端)，正常光照培养4周左右，诱导出不定芽，诱导率可达285％；
43.诱导培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
44.该诱导培养基为：ms+6
‑
ba 1.8mg/l+naa 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.0g/l。
45.在此诱导培养条件与诱导培养基的环境下，能够最大程度上提高不定芽的诱导率。
46.s3、增殖培养：
47.选取分化良好、生长情况基本一致(株高≥3cm)的试管苗，切成1
‑
2cm的茎段，切除多余的叶片，每段带有至少一个节间及叶片，垂直接种至增殖培养基中，培养4周，获得丛生芽(见图2)；增殖系数为3.5，不定芽生长健壮，叶片浓绿色。
48.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
49.所述增殖培养基为：ms+6
‑
ba 0.8mg/l+naa 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.0g/l。
50.在增殖过程中,不定芽的生长是个曲线生长过程,生长速度从启动生长—快速生长—缓慢生长的过程,为了实现增殖培养高效的繁殖速度,需要培养过程中细致观察,在最
恰当的时间进行继代培养。同时不定芽的来源往往是腋芽或间接的愈伤组织等,继代培养代数太短往往繁殖效率低,继代培养代数过长往往伴随玻璃化危害、退化等情况的发生。在此培养条件与增殖培养基的环境下，能够最大程度上保证不定芽生长的状态，提高不定芽的存活率。
51.s4、生根培养：
52.选取分化良好、生长均匀(株高≥4cm)的丛生芽切分成单株，垂直接种于生根培养基中，培养15天，获得生根苗(见图3)，生根率可达100％，根系乳白色，富有弹性。
53.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
54.所述生根培养基为：1/2ms+iaa 0.5mg/l+ac 1.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.0g/l。
55.生根培养是植物组织培养的主要步骤，一般来说是当植物增殖培养后，采用适当的培养基配合一定浓度和比例的激素诱导植物生根的过程，在此培养条件与此浓度的生根培养基的环境下，能够大大提高幼株的生根率。
56.s5、炼苗、移栽：
57.预处理，将试管苗放在室温中，打开瓶盖倒入自来水再将瓶盖盖在瓶口上(不拧紧)，2
‑
3天后拿掉瓶盖；20
‑
25℃保持瓶内有充足的自来水，放置在温室中弱光下2
‑
3天。
58.取出生根苗，清洗掉培养基，杀菌剂浸泡30分钟，种于基质中，自然光下炼苗3周，成活率100％。获得
‘
黄花’月见草穴盘苗(见图4)，小苗生长健壮。
59.通过依次采用上述各个步骤才能获得具有母本优良性状的再生植株，克服了以往通过诱导愈伤再分化植株时，后代出现变异等问题。本发明在外植体的培育过程中，在外植体生长的不同阶段采用不同细胞分裂素6
‑
ba和生长素naa、iaa等激素浓度的配比，有利于外植体的生长发育，保障
‘
黄花’月见草试管苗的质量。利用本发明的炼苗、移栽技术，对试管苗进行驯化，使其完全适应外部环境，移栽成活率可达100％，小苗质量好。并且只有依次采用上述步骤和参数才能达到，上述参数都是申请人付出创造性劳动和经过无数次试验获得的，具有较好的经济推广前景。
60.实施例二：
61.参照图1，为实施例2的一种
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法，包括以下步骤：
62.s1：外植体的选择和处理，于当年健康的幼枝作为外植体，去除多余叶片及叶柄，切分成1cm大小并带有节间且保留一片1/3大小叶片的茎段，利用灭菌剂进行消毒，无菌水浸洗；
63.其中选取半硬化的枝条作为所述外植体，灭菌剂为75％酒精，5％次氯酸钠，灭菌时间分别是30s和10min。
64.s2：不定芽的诱导，将经过步骤s1处理的外植体切除部分的伤口垂直接种于诱导培养基上，光照培养4周，获得不定芽；
65.所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为1.8mg/l、naa浓度为0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6；
66.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
67.s3：增殖培养，将步骤s2中获得的外植体切成1cm的茎段，切除多余的叶片，每个茎段带有一个节间且保留1片叶片，接种至增殖培养基中，培养4周，获得丛生芽(见图2)；
68.所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为0.8mg/l、naa浓度为
0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6，进行切段的所述外植体的株高在3cm。
69.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
70.s4：生根培养，将步骤s3中获得丛生芽切分成单株，接种于生根培养基中，培养15天，获得生根苗(见图3)；
71.所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，添加iaa浓度为0.3mg/l、ac浓度为1.0g/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6，进行切分的外植体的株高在4cm以上。
72.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
73.s5：炼苗、移栽，将步骤s4中的试管苗放在室温中，预处理1周后，取出生根苗，清洗掉培养基，杀菌剂浸泡30分钟，种于配制好的基质中，遮光炼苗，空气湿度保持在60％，1周后置于自然光下，获得
‘
黄花’月见草再生植株(见图4)。其中，预处理包括以下步骤：
74.半打开瓶盖倒入自来水；
75.放置在温室中弱光下2天，20℃保持瓶内有充足的自来水；
76.炼苗、移栽过程的基质中，草炭：珍珠岩：蛭石体积比＝6：1：3。
77.实施例三：
78.参照图1，为实施例3的一种
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法，包括以下步骤：
79.s1：外植体的选择和处理，于当年健康的幼枝作为外植体，去除多余叶片及叶柄，切分成2cm大小并带有节间且保留一片1/3大小叶片的茎段，利用灭菌剂进行消毒，无菌水浸洗；
80.其中选取半硬化的枝条作为所述外植体，灭菌剂为75％酒精，5％次氯酸钠，灭菌时间分别是30s和10min。
81.s2：不定芽的诱导，将经过步骤s1处理的外植体切除部分的伤口垂直接种于诱导培养基上，光照培养4周，获得不定芽；
82.所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为1.8mg/l、naa浓度为0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6；
83.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
84.s3：增殖培养，将步骤s2中获得的外植体切成2cm的茎段，切除多余的叶片，每个茎段带有一个节间且保留2片叶片，接种至增殖培养基中，培养4周，获得丛生芽(见图2)；
85.所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为0.8mg/l、naa浓度为0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6，进行切段的所述外植体的株高在5cm。
86.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
87.s4：生根培养，将步骤s3中获得丛生芽切分成单株，接种于生根培养基中，培养15天，获得生根苗(见图3)；
88.所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，添加iaa浓度为1.0mg/l、ac浓度为1.0g/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6，进行切分的外植体的株高在4cm以上。
89.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
90.s5：炼苗、移栽，将步骤s4中的试管苗放在室温中，预处理1周后，取出生根苗，清洗掉培养基，杀菌剂浸泡30分钟，种于配制好的基质中，遮光炼苗，空气湿度保持在70％，1周后置于自然光下，获得
‘
黄花’月见草再生植株(见图4)。其中，预处理包括以下步骤：
91.半打开瓶盖倒入自来水；
92.放置在温室中弱光下3天，25℃保持瓶内有充足的自来水；
93.炼苗、移栽过程的基质中，草炭：珍珠岩：蛭石体积比＝6：1：3。
94.实施例四：
95.参照图1，为实施例4的一种
‘
黄花’月见草种苗的繁育方法，包括以下步骤：
96.s1：外植体的选择和处理，于当年健康的幼枝作为外植体，去除多余叶片及叶柄，切分成1.5cm大小并带有节间且保留一片1/3大小叶片的茎段，利用灭菌剂进行消毒，无菌水浸洗；
97.其中选取半硬化的枝条作为所述外植体，灭菌剂为75％酒精，5％次氯酸钠，灭菌时间分别是30s和10min。
98.s2：不定芽的诱导，将经过步骤s1处理的外植体切除部分的伤口垂直接种于诱导培养基上，光照培养4周，获得不定芽；
99.所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为1.8mg/l、naa浓度为0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6；
100.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
101.s3：增殖培养，将步骤s2中获得的外植体切成1.5cm的茎段，切除多余的叶片，每个茎段带有一个节间且保留2片叶片，接种至增殖培养基中，培养4周，获得丛生芽(见图2)；
102.所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，添加6
‑
ba浓度为0.8mg/l、naa浓度为0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6，进行切段的所述外植体的株高在4cm。
103.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
104.s4：生根培养，将步骤s3中获得丛生芽切分成单株，接种于生根培养基中，培养15天，获得生根苗(见图3)；
105.所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，添加iaa浓度为0.65mg/l、ac浓度为1.0g/l、蔗糖30g/l、琼脂7.0g/l，ph为6，进行切分的外植体的株高在4cm以上。
106.培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
107.s5：炼苗、移栽，将步骤s4中的试管苗放在室温中，预处理1周后，取出生根苗，清洗掉培养基，杀菌剂浸泡30分钟，种于配制好的基质中，遮光炼苗，空气湿度保持在65％，1周后置于自然光下，获得
‘
黄花’月见草再生植株(见图4)。其中，预处理包括以下步骤：
108.半打开瓶盖倒入自来水；
109.放置在温室中弱光下2.5天，22.5℃保持瓶内有充足的自来水；
110.炼苗、移栽过程的基质中，草炭：珍珠岩：蛭石体积比＝6：1：3。
111.本实施例的实施原理为：本发明利用
‘
黄花’月见草的幼茎作为外植体诱导不定芽，建立一套稳定的
‘
黄花’月见草植株再生体系，获得的组培苗具有母本优良性状，一年四季皆可进行种苗生产繁育工作，克服
‘
黄花’月见草因分根、扦插繁殖造成的品种退化，繁育受季节限制等的弊端，实现
‘
黄花’月见草组培苗的再生并有效进行大量繁育。
112.本发明以
‘
黄花’月见草当年生的幼茎作为外植体材料，诱导产生不定芽，4周后可以获得具有母本优良性状的再生植株，克服了以往通过诱导愈伤再分化植株时，后代出现变异等问题。本发明在外植体的培育过程中，在外植体生长的不同阶段采用不同细胞分裂素6
‑
ba和生长素naa、iaa等激素浓度的配比，有利于外植体的生长发育，保障
‘
黄花’月见草试管苗的质量。利用本发明的炼苗、移栽技术，对试管苗进行驯化，使其完全适应外部环境，
移栽成活率可达100％，小苗质量好。
113.本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。