一种犬的急性肾衰竭模型建立的方法

1.本发明属于急性肾衰竭模型构建技术领域，尤其涉及一种犬的急性肾衰竭模型建立的方法。


背景技术：

2.目前，在急性肾功能衰竭的基础与临床研究中，为了深入了解急性肾衰竭形成的过程，探究急性肾衰竭的形成机制，建立急性肾衰竭试验动物模型尤为重要。目前国内外研究中所用到的急性肾衰竭试验动物模型，大多是在大鼠或家兔等试验动物上建立的，通过物理或化学药物的方法达到建立急性肾衰竭动物模型的目的。
3.物理方法主要有两种，一种是通过物理机械的方法使肾组织缺血，引起肾小管上皮细胞变性坏死从而使动物发生急性肾衰竭；另一种是通过切除部分肾组织，或直接断绝肾脏部分大血管的血液供应。该种方法对术者操作要求较高，且手术过程易造成出血，导致试验动物意外死亡。另外通过化学药物方法，如腺嘌呤、甘油、油酸、氯化汞、氨基糖苷类药物和阿霉素类药物等使流经肾脏的血液大幅减少，建立急性肾衰竭的模型。该种方法成本较低，操作简单，模型较为稳定可以进行动态观察。
4.临床上对于犬肾衰竭的诊断和治疗研究较为深入，但是对其发病相关机理研究较少。目前关于犬急性肾衰竭的造模方法大多为采用物理方法或者是化学药物，这对动物自身的伤害较大，可能会导致动物急性死亡，加上犬肾衰是一种多种原因均可引起的一种综合性疾病，所以在造模上研究较少。腺嘌呤在机体黄嘌呤氧化酶的作用下可以生成难以溶于水的物质，这种物质沉积在肾小管无法排出体外，导致肾小管的堵塞，最终引发氮质血症和代谢紊乱，导致急性肾衰竭的发生。但现有技术中关于利用腺嘌呤进行急性肾衰竭模型构建的方案尚未见报道。因此，亟需一种新的基于腺嘌呤的急性肾衰竭模型建立的方法，以弥补现有技术的空白。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于利用腺嘌呤进行急性肾衰竭模型构建的方案尚未见报道，且腺嘌呤造犬急性肾衰竭模型的最佳剂量尚不清楚。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：前期需要进行多次预实验以确定合适的腺嘌呤剂量范围，从而划定浓度梯度进行后续实验以确定腺嘌呤造急性肾功能衰竭模型犬的最佳剂量。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：目前国内外报道的造急性肾衰竭模型动物的实验动物大多为大鼠和家兔，很少能查阅到关于造急性肾功能衰竭模型犬的资料，且大多通过物理或化学药物的方法达到建立急性肾衰竭动物模型的目的。利用化学药物腺嘌呤造模，该种方法成本较低，操作简单，模型较为稳定可以进行动态观察；同时通过此试验能确定腺嘌呤造急性肾衰竭模型犬的最佳剂量，为广大科研试验者和临床犬肾衰相关的研究提供理论支撑，为后续临床试验提供参考资料，便于更进一步的掌握急性肾衰功能衰竭机理。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种犬的急性肾衰竭模型建立的方法。
9.本发明是这样实现的，一种犬的急性肾衰竭模型建立的方法，所述犬的急性肾衰竭模型建立的方法包括以下步骤：
10.步骤一，进行试验动物的确定及分组；
11.步骤二，进行仪器和试剂的确定；
12.步骤三，进行样品的采集；
13.步骤四，进行指标的测定；
14.步骤五，进行统计分析。
15.在本发明中：步骤一：选取健康的动物，按照程序饲养；遵循实验动物随机分组原则；步骤三：为后续指标检测做准备；步骤四：进行指标检测，通过观察结果动态分析造模犬状态，判定造模是否成功，灵活调整试验；步骤五：将结果进行统计学分析，综合步骤四判定造模结果，最后得出结论。
16.进一步，步骤一中，所述试验动物的确定及分组，包括：
17.从犬场购进2岁，体重为4
±
1kg的贵宾犬15只；购进后进行身体全面检查，确保犬只健康。试验前期进行2周的适应性饲养，将犬随机分为3组：空白对照组，即c组每天饲喂基础犬粮，自由饮用自来水；40mg腺嘌呤模型组在饲喂基础犬粮的同时按体重添加腺嘌呤40mg/kg
·
d；75mg腺嘌呤模型组在饲喂基础犬粮的同时按体重添加腺嘌呤75mg/kg
·
d。
18.试验周期为15天，犬只饲养采用自由采食和饮水的饲养方式，定期观察犬的饮食、饮水和精神状况；试验过程中环境条件、基础犬粮、饲养管理均保持一致。根据剂量换算，由大鼠剂量200-250mg/kg
·
d查表换算出犬造模剂量为40-75mg/kg
·
d。整个试验严格按照华中农业大学动物保护与利用委员会中国武汉批准的规程进行。
19.进一步，步骤二中，所述仪器和试剂，包括
20.所述仪器，包括动物专用掌上尿液分析仪，台式高速冷冻离心机，光学显微镜，标准试剂型纯水仪，移液枪以及酶标仪；
21.所述试剂，包括血肌酐，血尿素氮，纯度≥99.5％的腺嘌呤，纯度≥99％的纳米硒以及2ml、5ml的注射器。
22.进一步，步骤三中，所述样品的采集，包括：
23.(1)血样的采集
24.在试验的第1、8和15天，用真空采血管和采血针经犬的前肢头静脉采血3ml，分离血清后于冰箱冻存，检测血肌酐和血尿素氮；
25.(2)尿液的采集
26.在试验的第1、8和15天，用注射器经膀胱穿刺采尿2ml，在30min以内送至华中农业大学动物医院检验科进行尿常规检测；
27.(3)肾组织的采集
28.在试验最后一天采集左侧肾脏，分离脂肪囊和纤维膜后，将肾脏组织切成小块固定于4％的多聚甲醛中，用于制作石蜡切片，剩下部分冻存超低温冰箱。
29.进一步，步骤四中，所述指标的测定，包括：
30.(1)进行尿常规的测定；
31.(2)进行犬血清肌酐指标测定；
32.(3)进行犬血清尿素氮指标测定；
33.(4)进行肾脏组织切片观察。
34.进一步，步骤(1)中，所述尿常规的测定，包括：
35.收集的尿液样本于30min内进行尿液常规检测。将尿液倒入灭菌的离心管中，使尿液检测试纸条全部被尿液浸润，将浸润的试纸条放于尿液分析仪上进行检测并记录结果。
36.进一步，步骤(2)中，所述犬血清肌酐指标测定，包括：
37.使用肌酐测定试剂盒利用除蛋白法进行检测。分别设立试剂空白管、标准管以及测定管，测定管分别标号1～15号；在测定管中加入0.2ml血清，再加入钨酸蛋白沉淀剂2ml，充分混匀，3500r/min，离心10min，取上清液备用。每管加入苦味酸溶液0.5ml，0.75mol/l氢氧化钠溶液0.5ml。空白管加入双蒸水1.6ml，标准管加入50μmol/l肌酐标准品1.6ml，测定管加入1.6ml上一步制备的上清液。充分混合后置于37℃水浴锅中水浴10min后取出流水冷却，波长510nm，光径1cm，双蒸水调零，测定各管的吸光度od值。
38.计算公式为：
[0039][0040]
进一步，步骤(3)中，所述犬血清尿素氮指标测定，包括：
[0041]
分别设立试剂空白管、标准管以及测定管，测定管分别标号1～15号。空白管、标准管以及测定管中分别加入1g/l肟溶液和酸溶液各1ml。空白管中加入双蒸水0.02ml，标准管中加入0.02ml的10mmol/l尿素氮标准品，测定管中加入0.02ml的待测血清，充分混合后置于沸水中准确水浴15min后取出流水冷却，波长520nm，光径1cm，双蒸水调零，测定各管的吸光度od值。
[0042]
计算公式为：
[0043][0044]
进一步，步骤(4)中，所述肾脏组织切片观察，包括：
[0045]
将固定的肾组织从多聚甲醛中取出，修整切块，将修整好的组织块放入石蜡中进行包埋后，进行切片；在切片机上将组织块切成5μm厚的切片，经过二甲苯和不同梯度的酒精进行脱水透明后，再用苏木素伊红进行染色，最后用中性树胶封片以后进行光学显微镜的观察。
[0046]
进一步，步骤五中，所述统计分析，包括：
[0047]
用spss 16.0统计软件进行数据分析，所有数据均以平均数
±
标准差，即mean
±
sd表示，采用单因素方差分析；#表示与空白对照组c相比，
#
p《0.05表示差异显著，
##
p《0.05表示差异极显著。
[0048]
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的犬的急性肾衰竭模型建立的方法，采用腺嘌呤来诱导建立犬急性肾衰竭的模型，通过血液和
尿液等指标的检测及肾脏组织病理学变化来判断模型是否成功建立，进而确定腺嘌呤诱导犬急性肾衰竭的最佳剂量,确定造急性肾衰竭模型犬的腺嘌呤最佳剂量为75mg/kg
·
d。在进行本实验之前可供参考的关于利用腺嘌呤造急性肾衰竭犬的资料十分有限，对于研究犬急性肾衰竭的发病进程和机理及后续用药有一定的困难；本发明通过一系列试验得出由腺嘌呤诱导的犬的急性肾功能衰竭的最佳剂量为75mg/kg
·
d，为广大科研工作者和临床相关研究提供了部分可参考的资料。
[0049]
在本试验中，通过病理组织观察发现：在试验的第15天，40mg腺嘌呤模型组肾小管上皮细胞有轻度变性；75mg腺嘌呤模型组肾脏病理变化明显，主要表现为肾小球萎缩，肾小管上皮细胞变性坏死脱落，肾小管扩张。75mg腺嘌呤造模所导致的病理变化同急性肾衰竭时肾脏的病理变化相似，血清尿素氮升高，血清肌酐达到正常参考值上限的1.5～2倍，这与前人的研究结果相一致。综合结果表明：75mg腺嘌呤模型组所用造模剂量合适，动物既能达到急性肾衰竭的理想造模状态，也能避免手术等对试验动物造成额外的伤害，引起动物急性死亡。
[0050]
在本试验中，通过采用40mg/kg
·
d和75mg/kg
·
d两种剂量的腺嘌呤对犬进行急性肾衰竭模型的建立，试验结果表明：给犬添加75mg/kg
·
d的腺嘌呤15天后，血清肌酐的浓度增加到226.86μmol/l，血清尿素氮的浓度增加到18.95mmol/l，尿比重降低到1.009，尿ph值下降到5.61。同时，在对第15天肾脏组织病理切片的观察中发现，与空白对照组相比，给犬添加75mg/kg
·
d的腺嘌呤对肾组织造成的损伤更加符合犬急性肾衰竭模型中肾脏的病理变化，而添加40mg/kg
·
d的腺嘌呤，犬各项指标均未达到急性肾衰竭的判定标准，因此给犬添加75mg/kg
·
d的腺嘌呤可以成功建立急性肾衰竭的模型。
附图说明
[0051]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0052]
图1是本发明实施例提供的犬的急性肾衰竭模型建立的方法流程图。
[0053]
图2是本发明实施例提供的肾脏病理学观察结果示意图；
[0054]
图中：c：空白对照组；40：40mg腺嘌呤模型组；75：75mg腺嘌呤模型组。
具体实施方式
[0055]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0056]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种犬的急性肾衰竭模型建立的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0057]
如图1所示，本发明实施例提供的犬的急性肾衰竭模型建立的方法包括以下步骤：
[0058]
s101，进行试验动物的确定及分组；
[0059]
s102，进行仪器和试剂的确定；
[0060]
s103，进行样品的采集；
[0061]
s104，进行指标的测定；
[0062]
s105，进行统计分析。
[0063]
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
[0064]
在本试验中，本发明采用腺嘌呤来诱导建立犬急性肾衰竭的模型，通过血液和尿液等指标的检测及肾脏组织病理学变化来判断模型是否成功建立，进而确定腺嘌呤诱导犬急性肾衰竭的最佳剂量。
[0065]
1、材料与方法
[0066]
1.1试验动物与分组
[0067]
从湖北某犬场购进2岁左右，体重大约为4
±
1kg的贵宾犬15只。购进后进行身体全面检查，确保犬只健康。试验前期进行2周的适应性饲养，将犬随机分为3组：空白对照组(c组)每天饲喂基础犬粮，自由饮用自来水；40mg腺嘌呤模型组在饲喂基础犬粮的同时按体重添加腺嘌呤40mg/kg
·
d；75mg腺嘌呤模型组在饲喂基础犬粮的同时按体重添加腺嘌呤75mg/kg
·
d。试验周期为15天，犬只饲养采用自由采食和饮水的饲养方式，定期观察犬的饮食、饮水和精神状况。试验过程中环境条件、基础犬粮、饲养管理均保持一致。根据相关文献的剂量换算，由大鼠剂量200-250mg/kg
·
d查表换算出犬造模剂量为40-75mg/kg
·
d。整个试验严格按照华中农业大学动物保护与利用委员会(中国武汉)批准的规程进行。
[0068]
1.2仪器和试剂
[0069]
动物专用掌上尿液分析仪(abaxis ua analyzer，爱贝斯公司)
[0070]
台式高速冷冻离心机(sigma，3k15，德国希格玛公司)
[0071]
光学显微镜(olympus，cx41，日本奥林巴斯光学株式会社)
[0072]
标准试剂型纯水仪(fbz2001-up-p，青岛富勒姆科技有限公司)
[0073]
移液枪(eppendorf，德国艾本德公司)
[0074]
酶标仪(mμliskanmk3，赛默飞世尔科技公司)
[0075]
血肌酐(cre，c011-1-1，除蛋白法，南京建成生物工程研究所)
[0076]
血尿素氮(bun，c013-1-1，二乙酰肟比色法，南京建成生物工程研究所)
[0077]
腺嘌呤(纯度≥99.5％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)
[0078]
纳米硒(纯度≥99％，macklin生化有限公司)
[0079]
注射器(2ml、5ml，生产批号20160716，武汉市王冠医疗器械有限责任公司)
[0080]
1.3样品的采集
[0081]
1.3.1血样的采集
[0082]
在试验的第1、8和15天，用真空采血管和采血针经犬的前肢头静脉采血3ml，分离血清后于冰箱冻存，检测血肌酐和血尿素氮。
[0083]
1.3.2尿液的采集
[0084]
在试验的第1、8和15天，用注射器经膀胱穿刺采尿2ml，在30min以内送至华中农业大学动物医院检验科进行尿常规检测。
[0085]
1.3.3肾组织的采集
[0086]
在试验的最后一天，采集左侧肾脏，分离脂肪囊和纤维膜后，将肾脏组织切成小块固定于4％的多聚甲醛中，用来制作石蜡切片，剩下的部分冻存超低温冰箱。
[0087]
1.4测定指标和方法
[0088]
1.4.1尿常规的测定
[0089]
收集的尿液样本于30min内进行尿液常规检测。将尿液倒入灭菌的离心管中，使尿液检测试纸条全部被尿液浸润，将浸润的试纸条放于尿液分析仪上进行检测并记录结果。
[0090]
1.4.2犬血清肌酐指标测定
[0091]
使用肌酐测定试剂盒(除蛋白法)进行检测。分别设立试剂空白管、标准管以及测定管，测定管分别标号1-15号。在测定管中加入0.2ml血清，再加入钨酸蛋白沉淀剂2ml，充分混匀，3500r/min，离心10min，取上清液备用。每管加入苦味酸溶液0.5ml，0.75mol/l氢氧化钠溶液0.5ml。空白管加入双蒸水1.6ml，标准管加入50μmol/l肌酐标准品1.6ml，测定管加入1.6ml上一步制备的上清液。充分混合后置于37℃水浴锅中水浴10min后取出流水冷却，波长510nm，光径1cm，双蒸水调零，测定各管的吸光度od值。
[0092]
计算公式：
[0093][0094]
1.4.3犬血清尿素氮指标测定
[0095]
分别设立试剂空白管、标准管以及测定管，测定管分别标号1-15号。空白管、标准管以及测定管中分别加入1g/l肟溶液和酸溶液各1ml。空白管中加入双蒸水0.02ml，标准管中加入0.02ml的10mmol/l尿素氮标准品，测定管中加入0.02ml的待测血清，充分混合后置于沸水中准确水浴15min后取出流水冷却，波长520nm，光径1cm，双蒸水调零，测定各管的吸光度od值。
[0096]
计算公式：
[0097][0098]
1.4.4肾脏组织切片观察
[0099]
将固定的肾组织从多聚甲醛中取出，修整切块，将修整好的组织块放入石蜡中进行包埋，然后进行切片。在切片机上将组织块切成5μm厚的切片，然后再经过二甲苯和不同梯度的酒精进行脱水透明，再用苏木素伊红进行染色，最后用中性树胶封片以后进行光学显微镜的观察。
[0100]
1.5统计分析
[0101]
用spss 16.0统计软件进行数据分析，所有数据均以平均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，采用单因素方差分析，(#)表示与空白对照组(c)相比，
#
p《0.05表示差异显著，
##
p《0.05表示差异极显著。
[0102]
2、结果
[0103]
2.1犬的临床症状观察
[0104]
在整个试验期间40mg腺嘌呤模型组犬采食量、饮水量和精神状态均同空白对照组相同，未出现呕吐和腹泻等症状。75mg腺嘌呤模型组犬在试验中后期出现饮食欲下降，个别犬出现不同程度的呕吐、血便和精神沉郁。排尿初期正常，中期增多，在试验的后期，实验动
物排尿量急剧减少甚至无尿，尿液颜色加深且略微浑浊。
[0105]
2.2尿比重和尿ph值变化
[0106]
犬尿比重和尿ph值检测结果见表1和表2。用不同剂量的腺嘌呤处理以后，与c组犬相比，在试验第8天和第15天时，40mg腺嘌呤模型组犬的尿比重和尿ph值有降低，但无差异显著性(p》0.05)；在试验第8天和第15天时，75mg腺嘌呤模型组犬的尿比重和尿ph值均有降低，与c组犬尿比重相比差异显著(p《0.05)，与c组犬尿ph值相比差异极显著(p《0.01)。
[0107]
表1急性肾衰发生过程中犬尿比重的变化(n＝5)
[0108][0109]
注：(
#
)表示同一时期与空白对照组相比，p《0.05
[0110]
表2急性肾衰发生过程中犬尿ph的变化(n＝5)
[0111][0112]
注：(
##
)表示同一时期与空白对照组相比，p《0.01
[0113]
2.3血清生化指标
[0114]
表3急性肾衰发生过程中犬血清肌酐的变化(μmol/l)(n＝5)
[0115][0116]
注：(
##
)表示同一时期与空白对照组相比，p《0.01
[0117]
表4急性肾衰发生过程中犬血清尿素氮的变化(mmol/l)(n＝5)
[0118][0119]
注：(
##
)表示同一时期与空白对照组相比，p《0.01
[0120]
由表3和表4得知，在试验第8天和第15天时，通过对血清生化指标中肌酐和尿素氮检测发现：40mg模型组犬和75mg模型组犬的生化指标较c组均有增加，但只有75mg模型组犬血清cre和bun较c组相比极显著增加(p《0.01)。
[0121]
2.4肾脏病理学观察结果
[0122]
如图2所示，当造模进行至15天时，c组犬肾脏组织未见有明显病理变化，与c组相比，40mg腺嘌呤模型组犬肾小管上皮细胞仅有轻度空泡变性；75mg腺嘌呤模型组犬肾脏损伤明显，组织结构紊乱，肾小管上皮细胞变性坏死，管腔扩张，肾小球萎缩，体积变小。灰色箭头：肾小管上皮轻度空泡变性；红色箭头：肾小球萎缩；黑色箭头：肾小管上皮细胞部分脱落坏死，肾小管管腔扩大。c：空白对照组；40：40mg腺嘌呤模型组；75：75mg腺嘌呤模型组。
[0123]
3、讨论
[0124]
3.1腺嘌呤诱导的犬急性肾衰竭动物模型的建立
[0125]
大量的腺嘌呤在体内积聚，体内高浓度的腺嘌呤通过氧化反应之后，生成2，8-二羟基腺嘌呤，该种物质无法同体内代谢废物经尿液排出体外，过量的产物积聚在肾脏中，不断刺激肾脏，堵塞肾小管管腔，引发急性肾衰竭。徐曼等研究证明，大量的腺嘌呤通过一系列的氧化作用会生成尿酸通过肾脏的排泄作用排出体外，当尿酸的浓度大于8.5mg/dl的时候，尿酸会析出结晶颗粒无法随尿液排出体外，沉积在肾脏肾盂或管腔中，由于沉积部位的血液流通不畅，导致血液中额养分无法供给营养肾组织，肾脏组织细胞会崩解、脱落、坏死，细胞坏死崩解产物，将引起大量炎性细胞的浸润和吞噬，使得肾脏发生严重的炎症反应。从不同动物建立的肾衰竭模型中发现肾衰竭过程中动物体内的氧自由基不断增加且将氧自由基顺利清除体外存在一定的障碍，并且，在肾衰竭动物机体中过氧化产物丙二醛增加的水平急剧升高。当部分肾单位被破坏之后，残存的肾单位会进行高代偿工作，耗氧量持续增加，最终导致肾脏组织的氧化受损。
[0126]
在本试验中，通过病理组织观察发现：在试验的第15天，40mg腺嘌呤模型组肾小管上皮细胞有轻度变性；75mg腺嘌呤模型组肾脏病理变化明显，主要表现为肾小球萎缩，肾小管上皮细胞变性坏死脱落，肾小管扩张。75mg腺嘌呤造模所导致的病理变化同急性肾衰竭时肾脏的病理变化相似，血清尿素氮升高，血清肌酐达到正常参考值上限的1.5-2倍，这与前人的研究结果相一致。综合结果表明：75mg腺嘌呤模型组所用造模剂量合适，动物既能达到急性肾衰竭的理想造模状态，也能避免手术等对试验动物造成额外的伤害，引起动物急性死亡。
[0127]
3.2腺嘌呤诱导的急性肾衰竭犬肾机能指标的变化
[0128]
当动物处于正常生理状态下时，肾脏的排泄功能正常，动物在生命活动中产生的代谢废物大部分经由尿液排出。当肾脏功能被破坏时，肾小球的滤过率会受到极大的影响，最终导致血液当中的代谢废物无法排出，血肌酐和血尿素氮的浓度升高。机体大部分的水都是主要经由肾小管重吸收作用被重吸收回机体。急性肾衰时，大部分肾小管被破坏，肾小管失去其重吸收作用，机体对尿液浓缩能力下降，相比正常生理状态下尿液中的水分增多，导致尿比重的降低。
[0129]
在本试验中，通过采用40mg/kg
·
d和75mg/kg
·
d两种剂量的腺嘌呤对犬进行急性肾衰竭模型的建立，试验结果表明：给犬添加75mg/kg
·
d的腺嘌呤15天后，血清肌酐的浓度增加到226.86μmol/l，血清尿素氮的浓度增加到18.95mmol/l，尿比重降低到1.009，尿ph值下降到5.61。同时，在对第15天肾脏组织病理切片的观察中发现，与空白对照组相比，给犬添加75mg/kg
·
d的腺嘌呤对肾组织造成的损伤更加符合犬急性肾衰竭模型中肾脏的病理变化，而添加40mg/kg
·
d的腺嘌呤，犬各项指标均未达到急性肾衰竭的判定标准，因此给犬添加75mg/kg
·
d的腺嘌呤可以成功建立急性肾衰竭的模型。
[0130]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。