菌株N-LY-1在制备抑菌促生长药物中的用途

菌株n-ly-1在制备抑菌促生长药物中的用途
技术领域
1.本发明涉及一种海洋细菌的用途，具体地说是涉及一种海胆鞘氨醇假单胞菌菌株n-ly-1在制备抑菌促生长药物中的用途。


背景技术：

2.目前植物病害的防治主要依靠化学防治，长期使用化学农药引起病原生物产生抗药性、土壤环境恶化、农产品农药残留、环境污染及食品安全等问题，严重制约着农业的可持续发展，威胁着人和动物的健康(王超等，2017)。生物防治弥补了化学防治的不足，具有对环境安全、低残留、不易产生抗药性、兼防兼治、促生等优势(李恩琛等，2020)，已经成为植物病害防治的安全有效手段，分离筛选抑菌防病作用强、促生作用机理不同的新型微生物菌株是开发高效农用微生物制剂的基础。
3.目前用于微生物制剂开发的微生物主要是来自陆源的木霉菌(trichoderma)、枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(p.fluorescens)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)等，细菌具有生长速度快、易培养、抗逆性强等特性，是重要的生防资源，其通过营养竞争、寄生、分泌拮抗性次级代谢产物及诱导植物产生抗性等多种方式防治植物病害(张晓梦等，2020)，并能够产生铁载体、iaa、赤霉素等激素，合成有利于植物生长发育的物质如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶细胞壁水解酶和抗菌蛋白，间接或直接提高植物的质量与产量，但经过长期筛选，得到新种类和新作用机制优良菌株的几率越来越低，人们把目光转向了海洋，海洋环境的特殊性，使海洋微生物具有耐盐、低温、寡营养、易培养、发酵耗能低、适应性广、易于在不同环境中定殖等特性，海洋微生物制剂具有陆源微生物制剂无法比拟的优势和潜力。
4.不同学者从海洋环境中筛选出了抑菌作用广，抗逆性更强的枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌等海洋微生物菌株，一些菌株已经开发成了微生物制剂，完成了农药或肥料的产品登记。聂亚锋等(2008)从连云港海域中分离到一株对水稻纹枯病等4种植物病原菌有抑菌活性的海洋细菌py-sw-1；黄庶识等(2010)从北部湾海域分离到海洋细菌mf-3、mf-6和mf-13，3株细菌对水稻纹枯病菌均具有抑菌活性，其中mf-6有较好的抑菌效果和广谱性，有望研发成防治水稻病害的新型农药；fang等(2012)从南大洋海域分离筛选出3株能够抑制水稻纹枯病菌、尖孢镰刀菌等7种植物病原菌的海洋细菌；张靖宜等(2014)自黄渤海海域的双齿围沙蚕中分离到一株对水稻纹枯病菌和小麦根腐病菌有抑菌作用的内生放线菌scf-18，具有潜在的开发价值；本实验室从连云港海域分离到对黄瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum)、小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌(thanatephorus cucumeris(frank)donk)等多种植物病原菌有强烈抑制作用，并能促进黄瓜等植物生长的多粘类芽孢杆菌(p.polymyxa)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus)gm-1、甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus)bmf04、栗褐连霉菌(streptomycesbadius)bm-2等多个优良海洋微生物菌株(葛平华等，2013；汪晶晶等，2015；万丹丹等，2020；马桂珍等，2014)，其中l
1-9、bmf03、bmf04等菌株分别开发出了可
湿性粉剂(陈茹等，2020)和水悬浮剂(马桂珍等，2021；暴增海等，2021)，获得国家发明专利。海洋微生物已经成为微生物制剂研制的重要优良菌株来源，研究海洋细菌的抑菌作用及其促生特性，为农用微生物生物制品提供新的菌种资源，具有重要的实践意义。
5.n-ly-1菌株是申请人的实验室从连云港海域高公岛鲈鱼肠道内分离得到的海洋细菌，有关该菌株的抑菌、促生作用及其机理尚未研究。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的海胆鞘氨醇假单胞菌菌株n-ly-1在制备抑菌促生长药物中的用途。
7.本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明海胆鞘氨醇假单胞菌菌株n-ly-1在制备抑菌药物中的用途，其特点是，海胆鞘氨醇假单胞菌n-ly-1在制备抑菌防病药物中的用途，其特征在于：以海胆鞘氨醇假单胞菌n-ly-1菌株或者发酵液为有效成份制备抑菌防病药物，且其所抑的菌为：苹果轮纹病菌(physalospora piricola)、黄瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum)、小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)、草莓灰霉病菌(botrytis cinerea)或者月季黑斑病(actinonema rosae(lib)fr.)。
8.本发明还公开了海胆鞘氨醇假单胞菌n-ly-1在制备植物生长促进剂中的用途，其特点是：以海胆鞘氨醇假单胞菌n-ly-1菌株或者发酵液为有效成份制备抑菌防病药物，所述的用途对黄瓜幼苗的生长的促进作用。植物生长促进剂使用时，通过浸种、拌土或者灌根的方式进行。
9.本发明所述的用途中：海胆鞘氨醇假单胞菌n-ly-1菌株发酵液浓度优选为1.0
×
103cfu/ml～105cfu/ml。
10.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
11.本发明提供了一种新的海胆鞘氨醇假单胞菌菌株n-ly-1在制备抑菌防病药物中的用途，它可以抑制植物生长过程中的苹果轮纹病菌(physalospora piricola)、黄瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum)、小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)、草莓灰霉病菌(botrytis cinerea)或者月季黑斑病(actinonema rosae(lib)fr.)。也可以作生长促进剂使用。
12.本发明采用平板对峙法、牛津杯法以及室内盆栽试验法测定n-ly-1菌株对植物病原真菌的抑菌作用以及对黄瓜的促生防病作用。
13.本发明所涉及的菌株n-ly-1为海胆鞘氨醇单胞菌(sphingomonas echinoides)n-ly-1菌株，已于2020年10月29日保藏在中国典型培养物保藏中心cctcc，其保藏号为：cctcc no:m 2020653，电话：027)87682319；传真:(027)87883833；e-mail:cctcc@whu.edu.cn；地址：武汉，武汉大学；邮编：430072。
附图说明
14.图1为n-ly-1菌株发酵液对不同病原菌的抑制作用图；图1中：ck：发酵液培养基；a：黄瓜枯萎病菌；b：小麦赤霉病；c：苹果轮纹病菌；d：苹果腐烂病菌；e：棉花立枯；f：玉米弯孢病菌；
15.图2为不同菌株在解磷和解钾培养基上的生长状态图；图2中，左：固氮培养基；中：解有机磷、钾；右：解无机磷、钾；注：1：n-ly-1菌株；2：酵母菌sym-1菌株；3：乳酸菌r-1菌株；4：大肠杆菌
16.图3为iaa的标准曲线；
17.图4为n-ly-1菌株产iaa的时间动态趋势。
具体实施方式
18.以下结合附图，进一下描述本发明的技术实施方式，以使本领域技术人员进一步地理解本发明，而不构成对本发明权利的限制。
19.实施例1
20.1材料与方法
21.1.1供试菌株
22.海洋细菌n-ly-1菌株，由本实验室从连云港海域高公岛鲈鱼肠道内中分离获得。
23.甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus))bmf 04；
24.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bmf 03；
25.大肠杆菌(escherichia coli)；
26.屎肠球菌(enterococcus faecium)r-1；
27.胶红酵母菌(rhodotorula mucilaginosa)sym-1以及12种植物病原真菌，均由本实验保存。
28.1.2供试培养基和黄瓜品种
29.n-ly-1菌株、黄瓜枯萎病菌活化及培养用培养基为pda培养基，n-ly-1菌株种子液和发酵液用培养基为pd；黄瓜种子品种为津正a206，绿哼科技股份有限公司生产，购自连云港市农业科学院种子中心。
30.1.3 n-ly-1菌株种子液、发酵液及无菌发酵液的制备
31.将培养18h的n-ly-1菌株用pd培养基洗下，接入到装有60ml pd培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min条件下振荡培养18h，调整浓度为108cfu/ml，作为发酵用种子液。
32.将种子液按10％的接种量接入到装有60ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h，为发酵液，发酵液8000r/min离心20min，上清液用0.22μm的细菌过滤膜过滤即为无菌发酵液。
33.1.4 n-ly-1菌株及其发酵液对不同植物病原菌的抑菌作用测定
34.在pda平板中间划线接种n-ly-1菌株，在其两侧距离划线2.5cm处接种直径为5mm的不同病原菌菌苔，28℃培养5d，测量抑菌带宽度，以bmf03菌株为阳性对照，每种病原菌3次重复。
35.在pda平板中央接种直径为5mm的不同病原菌菌苔，在距培养皿边缘15mm处对称放置4个牛津杯，每个牛津杯注入200μl无菌发酵液，28℃培养5d～7d，测量抑菌带宽度，每个病原菌3次重复，分别以等量发酵培养基和bmf03菌株为阴性和阳性对照。抑菌带宽度大于5mm判定为有抑菌活性，抑菌带越大，抑菌活性越好。
36.1.5 n-ly-1菌株发酵液对黄瓜生长的影响及其对黄瓜枯萎病的防治作用
37.参考现有技术方法制备黄瓜枯萎病接种物，并与土壤按质量比1:80混合均匀，制
成含病菌土壤，按每盆1220g的量装入体积为20cm
×
32cm的花盆中，每盆播种15粒种子。
38.1.5.1浸种 用不同浓度为的n-ly-1菌株发酵液浸泡黄瓜种子24h，均匀摆放在铺有2层湿润滤纸的培养皿内，28℃催芽24h，观察出芽数量，计算出芽率；露白后播种至含黄瓜枯萎病菌的土壤中，每一浓度为一处理，每一处理播种3盆为3次重复，以等体积的无菌水和发酵培养基作为对照组(ck1、ck2)。
39.1.5.2拌土将n-ly-1菌株发酵液与含黄瓜枯萎病菌土壤混合均匀，使土壤中n-ly-1菌株的含菌量为103cfu/g、104cfu/g、105cfu/g、106cfu/g，播种催芽的黄瓜种子，每个浓度为一处理，每个处理播种3盆为3重复，以等量的无菌水和发酵培养基为对照(ck1、ck2)。
40.1.5.3灌根 温汤浸种催芽后黄瓜种子播种于含黄瓜枯萎病菌的土壤中，黄瓜幼苗一叶期，分别用不同浓度的n-ly-1菌株发酵液灌根，每株幼苗5ml，每隔7d灌根一次，连续灌根3次，以等量的无菌水和发酵液灌根作为对照组(ck1、ck2)。
41.1.5.4促生作用及防病效果的调查统计 出苗后35d，参考王亚楠和陈莹莹(2020)的方法，测定不同处理株高、茎粗、干重、鲜重和须根数，调查不同处理黄瓜枯萎病的发病率、病情指数，计算防治效果。
42.发病率＝100％
×
病株数/调查总株数
43.病情指数＝100
×
∑(各级病株数
×
对应病级)/(调查总株数
×
最高病级)
44.防治效果％＝100％
×
(对照病指一处理病指)/对照病指
45.黄瓜枯萎病的分级标准参考张素平(2016)的方法。
46.1.6 n-ly-1菌株促生作用机理测定
47.参考(zhoubb，2018；bai jl，2017)方法制备蒙金娜有机磷、无机磷培养基、产吲哚乙酸(iaa)检测培养基、铬天青(chromeazurol s，cas)检测培养基、产铁载体定性检测培养基、固氮培养基、解钾固体培养基参考王欣玉的(2018)方法测定菌株解磷解钾作用、固氮作用、产iaa活性、产铁载体活性。
48.2结果与分析
49.2.1 n-ly-1菌株对植物病原菌的抑制作用
50.n-ly-1菌株和阳性对照bmf03菌株及其发酵液对供试的12种植物病原真菌的抑菌带宽度均大于5mm，均具有明显的抑制作用，对苹果轮纹病菌的抑制作用最强，菌株和发酵液的抑菌带宽度分别为15.9
±
0.1mm和28.5
±
0.3mm；其次是对小麦赤霉病菌的抑菌带宽度分别为12.0
±
0.2mm和27.9
±
0.2mm，其中发酵液对5种病原菌的抑菌带宽度高于对照，阳性对照结果与陈茹等(2018)的研究结果一致，说明本试验结果可靠。结果见表1。
51.表1 n-ly-1与对照菌株及其发酵液对不同病原菌的抑菌带宽度(mm)
[0052][0053]
注：同列不同小写字母表示差异极显著(p＜0.05)
[0054]
2.2 n-ly-1菌株发酵液不同处理对黄瓜苗生长的影响及其对黄瓜枯萎病的防治效果
[0055]
2.2.1浸种
[0056]
发酵液浓度在1.0
×
103～105cfu/ml范围内，出芽率、芽长、芽鲜重及其干重以及株高、茎粗、须根数等各项指标均显著高于对照，不同浓度的出芽率差异不显著，其他测定指标随发酵液浓度的提高而增加，发酵液浓度为105cfu/ml时各项指标最高，其后测定指标均有所下降，表明对黄瓜种子出芽和幼苗生长具有显著的促进作用，结果见表2、表3。
[0057]
表2 n-ly-1菌株不同浓度发酵液浸种对黄瓜种子发芽的影响
[0058][0059][0060]
注：不同字母表示差异极显著（p＜0.05）表3 n-ly-1菌株发酵液浸种对黄瓜幼苗的影响
[0061]
[0062]
注：不同字母表示差异极显著（p＜0.05）
[0063]
不同浓度的n-ly-1菌株发酵液对黄瓜枯萎病具有较高的防治作用，发酵液浓度1.0
×
103cfu/ml～105cfu/ml范围内，随着发酵液浓度的提高，黄瓜枯萎病的发病率和病情指数均逐渐降低，防治效果逐渐提高，浓度为105cfu/ml时防病效果最高，达81.5%，高于1.0
×
105cfu/ml，防病效果下降为63%，结果见表4。
[0064]
表4不同浓度n-ly-1菌株发酵液浸种处理对黄瓜枯萎病的防治效果
[0065][0066]
注：不同字母表示差异极显著（p＜0.05）
[0067]
2.2.2拌土发酵液拌土的黄瓜幼苗各项测定指标均高于对照，土壤含菌量1.0
×
103cfu/g～105cfu/g范围内，随着浓度的提高，所测定指标均逐渐增加，浓度为105cfu/ml时各项指标均最高，浓度提高，指标开始下降。结果见表5。说明拌土处理对黄瓜幼苗生长具有明显的促进作用。
[0068]
表5 n-ly-1菌株发酵液拌土处理对黄瓜幼苗生长的影响
[0069][0070]
注：不同字母表示差异极显著(p＜0.05)
[0071]
在供试浓度范围内，黄瓜枯萎病的发病率和病情指数显著低于对照，土壤含菌量为1.0
×
103cfu/g～105cfu/g范围内，随着含菌量增加发病率和病情指数逐渐降低，防病效果逐渐提高，105cfu/g时防病效果最高达72.2％，高于，防病效果下降为69.1％，结果见表6。
[0072]
表6 n-ly-1菌株发酵液拌土处理对黄瓜枯萎病的防治效果
[0073][0074]
注：不同字母表示差异极显著(p＜0.05)
[0075]
2.2.3灌根供试的发酵液浓度均能所测定各项指标均显著高于对照。浓度在1.0
×
103～104cfu/ml范围内的测定的各项指标随浓度的增加而提高，浓度为104cfu/ml时各项指标最高，浓度提高，指标开始下降。结果见表7。
[0076]
表7 n-ly-1菌株发酵液灌根处理对黄瓜幼苗生长的影响
[0077][0078]
注：不同字母表示差异极显著(p＜0.05)
[0079]
在供试浓度范围内，灌根处理的黄瓜枯萎病发病率和病情指数明显降低，浓度在1.0
×
103cfu/ml～104cfu/ml范围内，随着浓度的提高高发病率和病情指数逐渐下降，防病效果逐渐提高，104cfu/ml时最高，达67.6％，高于1.0
×
104cfu/ml防病效果下降为56.8％，结果见表8。
[0080]
表8不同浓度n-ly-1菌株发酵液灌根处理对黄瓜枯萎病的防治效果
[0081][0082]
注：不同字母表示差异极显著(p＜0.05)
[0083]
2.4 n-ly-1菌株对黄瓜生长的促生作用机理
[0084]
2.4.1固氮、解磷、解钾作用 n-ly-1菌株和阳性对照bmf04菌株及酵母菌sym-1菌株在固氮培养基上出现了正常菌落，而阴性对照大肠杆菌未形成菌落，表明n-ly-1菌株具有固氮作用；n-ly-1菌株及阳性对照乳酸菌r-1菌株在解有机磷培养基中上生长正常，并形成晕圈，晕圈直径与菌落直径比分别为1.89和2.23mm，阴性对照酵母菌sym-1菌株能够生
长，但无透明圈形成，说明菌株n-ly-1具有解有机磷作用，处理和对照菌株在解无机磷培养基和解钾培养基中均能生长，但均未出现晕圈，说明菌株无解无机磷和解钾作用(图2)。
[0085]
采用解磷、解钾培养基检测菌株是否具有解磷、解钾作用，菌株周围若有透明圈出现，则说明菌株具有解磷或解钾作用(李闯，2017)。固氮菌可将空气中的无机氮源转变成易被植物吸收利用的有机氮源，从而促进植物的生长发育(白娟娈，2017)。试验结果表明固氮、解磷、解钾作用是n-ly-1菌株促进植物生长的机理之一。
[0086]
2.4.2产iaa活性 n-ly-1菌株和阴性对照菌株在iaa检测培养基中培养1d，取上清液与salkowski’s显色剂暗反应20min，n-ly-1菌株处理变为粉红色，为阳性，阴性对照颜色未发生变化，说明该菌株具有合成iaa的能力。
[0087]
测定不同iaa浓度的od
530
，所建立的iaa标准曲线见图3，其回归方程为y＝0.0281x-0.0014，相关系数r2为0.9979。
[0088]
n-ly-1菌株iaa检测培养基中培养，在0-2d，随着时间的延长，iaa浓度逐渐升高，2d时iaa浓度最高，为2.17mg/l，其后iaa浓度逐渐下降，第5d时，iaa浓度仅有0.82mg/l。结果见图4。
[0089]
吲哚乙酸(iaa)是植物生长素，一定浓度的iaa能够促进植物生长(龚成君等，2021)。结果表明产iaa是n-ly-1菌株的促生机理之一。
[0090]
2.4.3产铁载体活性 n-ly-1菌株和阳性对照酵母菌sym-1菌株在cas检测平板上生长良好，培养2d菌落周围出现明显的黄色晕圈，阴性对照大肠杆菌未能生长，乳酸菌r-1菌株虽然生长但未出现黄色晕圈，说明n-ly-1菌株能够产生铁载体。铁载体是微生物或植物合成并分泌的一种螯合铁的用于摄取铁元素的低分子量化合物，主要存在于微生物中(细菌、真菌)，在胞内合成后被分泌到胞外，与环境中不易被植物吸收的fe
3+
结合，形成稳定的铁复合物，与植物细胞膜上的特异性受体结合，将铁元素运输到胞内，满足植物对铁元素的需求，促进植物生长(张垠等，2011)。试验结果表明产铁载体是n-ly-1菌株促进植物生长机理之一。
[0091]
3结论
[0092]
n-ly-1菌株及无菌发酵液对多种病原菌具有较强的抑制作用，浸种、拌土和灌根处理对黄瓜幼苗的生长具有明显的促进作用，对黄瓜枯萎病具有良好的防治效果，固氮、解有机磷作用、产生吲哚乙酸(iaa)和铁载体是该菌株的促生作用机制。