一种玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法

1.本发明涉及种子科学领域，特别是关于一种玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法。


背景技术：

2.20 世纪 80 年代诞生了将力学方法引入传统生物学研究中的新兴边缘学科——生物力学，并很快在国际上发展成为一个热点研究领域 , 但长期以来其研究对象主要集中在有关动物和人体的医学问题上，而作为这一学科内部的天然分支——植物力学则是近年来提出的新概念，尚有巨大发展空间。
3.植物生长发育中不可避免地要受到各种外界环境条件的刺激，这种刺激被称为环境应力刺激，它包括自然和人为的两大应力源。特别是环境应力的概念比传统单纯从光 、温、水、矿质等角度来研究植物生长要广泛得多。人们很早就认识到应力刺激会对植物的生长产生明显影响, 而使植物因感受应力刺激而产生宏观生物学效应，如：攀沿植物的向性生长；有些植物受到敲击后茎变粗变短，根受到敲击后生长受阻；风力作用导致的周期性震动能对植物的形态建成产生明显影响；一定强度的声波刺激能明显促进植物生长；水流动的剪切力会对水生植物的生长和形态产生影响等。此外，在机械振荡刺激、强声波（或超声波）刺激、电（磁）场、微重力状态（即空间失重环境）对植物的影响等方面也取得了一定进展。特别是现阶段一些科学家对植物细胞生长与应力刺激之间的关系进行了研究，包括通过对植物发育中目标组织/细胞开展应力加载实验等，以期揭示细胞内应力信号转导机理等, 但目前相关报道较少，非常值得深入研究。
4.生物力学的创始人、美国三院院士冯元桢先生说:“应力-生长关系是生物力学的活灵魂”，对于植物力学研究的核心更是如此。物理学为植物学的研究提供了现代化的实验手段和方法, 因此现阶段今后生物学家和物理学家都应大力开展这一边缘学科的研究,为传统植物学的研究注入新的方法和手段, 使之焕发出新的活力。
5.种子，在许多情况下也包括种子贮藏果实，是被子植物和裸子植物典型的传播和繁殖单位。在种子生物物理研究方面，整个种子或部分种子的力学性能主要在食品科学中进行研究，特别是断裂韧性、冲击损伤以及拉伸和压缩强度等。目前对种子或果实力学性能测量的作物主要有：豆类、橄榄、胡桃、向日葵、小麦等。在很大程度上，这些测量主要研究不同水分含量对力学性能的影响。
6.种子萌发开始于干种子吸收水分，并在部分胚组织延伸穿透其周围结构时完成。通常当胚覆盖层破裂和胚根出现时被认为发芽完成。从生物力学角度来看，能否完成种子（包括果实）萌发关键取决于两种相反作用力的平衡状态：胚轴（包括胚根-下胚轴生长区）的生长潜力和种子覆盖层（包括胚乳、种皮和果皮）的力学限制（阻力）。基于不同种子组织的细胞壁组分和吸水能力不同，可将各组织视为拥有不同动力学特性的复合材料。种子萌发中胚细胞生长生物力调控依赖于不可逆的细胞壁松弛，这使膨压（当水进入植物细胞后，使细胞产生向外施加在细胞壁上的压力，称为膨压）降低而吸水，进而导致胚伸长生长并最
终胚根伸出。胚乳弱化是胚根伸出的先决条件，这是被子植物种子萌发中普遍存在的现象。胚乳弱化的生物化学和分子机制已被大量综述总结报道。其中包括我们团队（http://www.seedbiology.de/index.html）建立的系列重要植物种子研究系统，并通过穿刺力等生物力学手段分析获得了胚乳弱化的直接证据，其中穿刺力指的是组织的最大强度。
7.感知机械力来控制基因表达、组织生长和命运是植物生命的重要组成部分。我们认为，种子构成了一个极好的研究力传感的系统，因为种子覆盖层和导致组织生长（胚）或死亡（珠孔胚乳）的不同命运之间存在明显的相互作用。前期我们团队在番茄、烟草、莴苣、咖啡和其他物种种子组织强度（胚乳弱化等）的直接穿刺力测量方面开展了大量研究工作（http://www.seedbiology.de/index.html），选择植物种子类型研究其系统发育中组织强度（胚乳弱化）机制的生物力学测量方法，将为对应植物属种子组织（胚乳）弱化的生物力学研究提供直接证据。如：为了研究烟草胚乳弱化的基础生物力学机制，近期我们刚实现了烟草这样的微小种子胚乳弱化生物力的测量技术方法，成功对珠孔胚乳和合点胚乳进行了穿刺力分析比较。
8.通过将生物力学与分子生物学有效结合可进一步阐明萌发过程和胚乳/胚根鞘弱化的基础机制。要全面了解种子的萌发过程，需要用综合的方法来阐明种子萌发的复杂调控及其分子基础，以了解多种物种组织力学中与细胞壁相关的变化。尽管人们对理解种子萌发的重要过程有着强烈的热情，但仍然存在一些未解决的问题。根据目前获得的证据表明，胚乳/胚根鞘弱化涉及进化保守以及物种特异性分子、生物化学、环境调节和生物力学机制。
9.玉米世界上最重要的粮饲作物之一，对推动国民农业经济发展具有举足轻重的作用。如：在中国，杂交玉米占玉米种植的95%以上，每年对杂交种子的需求量约为11亿公斤。而高质量玉米种子生产是全面提升现代农业发展水平的根本所在。种子活力作为玉米种子质量的重要指标，高活力种子具有萌发速度快，田间出苗抗逆能力强等特点。胚根鞘作为禾本科作物特有组织器官，在协助胚根突破果种皮机械束缚过程中发挥重要作用（jiang et al. (2011) qtl mapping of coleorhiza length in maize (zea mays l.) under two germination environmental conditions. plant breeding 130: 625-632），同样在种子萌发过程中它与其他植物胚乳可能存在类似的调控种子萌发的功能。目前对胚根鞘进行组织直接生物力测量的研究报道非常少，这归因于，在测量技术方面存在很大的难度，需要不断探索创新。前期，我们团队刚刚解决了野燕麦胚根鞘的生物力测量，并在new phytologist期刊上发表论文（holloway et al. (2020) coleorhiza-enforced seed dormancy: a novel mechanism to control germination in grasses.new phytologist 229 (4): 2179-2191），但在玉米胚根鞘的生物力测量方面一直存在种子萌发初期胚根与胚根鞘难分离、测定模型选择、测量参数确定等一系列技术难点，有待解决。此外，玉米种子可为禾本科植物种子胚根鞘弱化提供极好的生物力学研究系统，建立一套科学有效的玉米种子萌发胚根鞘弱化生物力测定的技术方法，为今后深入研究禾本科作物种子萌发机理具有重要意义。


技术实现要素：

10.本发明的目的是为满足生物力学与分子生物学有效结合的需要，以及在开展玉米
种子萌发机理研究中胚根鞘弱化生物力测量中存在的系列技术难点，而创新性提出了一种玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法，该技术方法的应用将为胚根鞘弱化调控玉米种子萌发机理研究提供直接的生物力学证据。
11.为了实现上述目的，本发明根据玉米种子独特的结构特征，特别是为玉米种子萌发过程中胚根鞘弱化调控机理研究提供直接生物力学证据。围绕“精准测定胚根鞘组织穿刺力大小”这一目标，发明一种玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法，包括研发了根鞘分离装置等，以实现玉米胚根鞘弱化生物力（穿刺力）信息采集工作。本发明采用以下技术方案获得一种玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法，其特征在于包括以下作业：（1）种子样品准备；（2）孔端组织切割；（3）根鞘组织分离；（4）胚根鞘的分取；（5）待测样的固定；（6）穿刺力的测定；（7）信息存储分析（见图1），其中作业（3）包括一种玉米根鞘分离装置研发，作业（5）包括一种玉米胚根鞘组织样品承载体研发。
12.所述作业（1）中，准备待测种子样品（根据研究需要确定种子萌发环境和取样时间点）发芽方式参考gb/t 3543.4农作物种子检验规程——发芽试验进行，本发明主要采取盖纸发芽和卷纸发芽两种方式。
13.所述作业（2）中，在显微体视镜下，根据种子形态，用手术刀对种子进行横切，留种孔端（含胚根和胚根鞘），弃后端（见图2）。
14.所述作业（3）中，为了实现根鞘组织分离，研发了一种玉米根鞘分离器（见图3-图5）它包括分离器转头、微型电钻、玻璃转管。利用玉米根鞘分离器完成玉米种子根鞘组织分离，使用时玻璃转管前端稍润湿，控制好转速，柔性推进；玻璃转管前部装满组织可折断去除，可伸出新的玻璃转管部分继续转取组织，包括将胚根完整取出（见图6）。
15.所述的分离器转头的前部为分离器帽，后部为电钻固定轴，中部有连帽轴、连帽轴螺纹、连尾轴、连尾轴螺纹。
16.所述的分离器帽有玻璃转管套、分离器帽内腔、分离器帽内腔螺纹。
17.所述的电钻固定轴有分离器尾、分离器尾防滑纹、玻璃转管伸缩控制按钮，前有分离器尾内腔、分离器尾内腔螺纹、电钻固定轴卡条。
18.所述的分离器转头内部有玻璃转管套、橡胶圈、分离器转头内槽、稳管器、稳管套、缩压帽、弹簧、稳管器卡头。
19.所述的微型电钻有转头固定夹、转头固定器、松紧环、松紧环防滑纹、变速控制器、电源开关、电钻固定卡口、电池。
20.所述的电池上有电池防滑纹，底部有充电口，并配有充电头、电源线。
21.所述作业（4）中，在体视镜下，用手术刀和镊子将移除胚根后的孔端组织中的胚根鞘剥离出来。
22.所述作业（5）中，根据玉米胚根鞘结构基于3d打印技术加工制作出透明模块（组织样品承载体组成部分），透明模块顶面有置样孔，底面有出针孔；透明模块上固定有垫片，垫片上有垫片孔，垫片孔与透明模块上的置样孔对应；将剥离出来的胚根鞘待测样放置在垫片孔和置样孔中即完成待测样固定作业（见图7）。
23.所述作业（6）中，将置样后的组织样品承载体固定在载样台上，选择金属探针、设定测量参数利用种子生物力测定系统（见图8）进行胚根鞘样品组织穿刺力测定。
24.所述作业（7）中，将胚根鞘生物力（穿刺力）测定信息（图像、数据等）进行存储，并
导出目标信息进行统计分析等。
25.图2-3中，分离器帽1、连帽轴2、连帽轴螺纹3、分离器转头4、连尾轴5、分离器尾6、分离器尾防滑纹7、电钻固定轴8、玻璃转管伸缩控制按钮9、玻璃转管10、玻璃转管套11、分离器帽内腔12、分离器帽内腔螺纹13、连尾轴螺纹14、分离器尾内腔15、分离器尾内腔螺纹16、电钻固定轴卡条17、橡胶圈18、分离器转头内槽19、稳管器20、稳管套21、缩压帽22、弹簧23、稳管器卡头24、微型电钻25、转头固定夹26、转头固定器27、松紧环28、松紧环防滑纹29、变速控制器30、电源开关31、电钻固定卡口32、电池33、电池防滑纹34、充电口35、充电头36、电源线37、金属探针38、胚根鞘样品39、垫片40、垫片孔41、透明模块42、置样孔43、出针孔44。
26.图1为本发明的作业流程图。
27.图2为本发明的种子样品孔端和后端分离示意图。
28.图3为本发明的玉米根鞘分离器的分离器转头结构示意图。
29.图4为本发明的玉米根鞘分离器的分离器转头内部结构示意图。
30.图5为本发明的玉米根鞘分离器的配套微型电钻结构示意图。
31.图6为本发明的玉米根鞘分离后的样品图。
32.图7为本发明的胚根鞘样品固定及穿刺力测定示意图。
33.图8为本发明的种子生物力测定系统。
34.图9为本发明的胚根鞘样品穿刺力测定结果曲线。
具体实施方式
35.下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
36.如图1所示，本发明通过对种子生物力进行测定，将生物力学与分子生物学有效结合更好地发现种子生长规律，阐明相关机理。本发明涉及的玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法包括种子样品准备、孔端组织切割、根鞘组织分离、胚根鞘的分取、待测样的固定、穿刺力的测定、信息存储分析等作业（见图1）和相关作业所需的玉米根鞘分离器研发等。该技术方法的应用将为胚根鞘弱化调控玉米种子萌发机理研究提供直接的生物力学证据。
37.本发明涉及的玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法具体实施方式如下。
38.（1）种子样品准备：胚根鞘弱化生物力测定主要采取盖纸发芽和卷纸发芽两种发芽方式对种子进行发芽处理，具体如下。
39.随机选取够量的待测种子样品用于发芽，首先在 1%naclo（w/v，北京化学试剂公司，中国）中进行表面消毒10min，然后用无菌水洗涤三次（在表面消毒之前用无菌水清洗包衣种子）。对于卷纸发芽，将两张发芽纸（如：anchor paper co.，usa）叠放并用无菌水润湿，用毛巾除去纸上多余水分，然后将灭菌的种子置床、卷起，垂直放入人工气候发芽箱中发芽（具体发芽环境和种子处理方法根据科研目的进行开展）。
40.盖纸发芽：取2张发芽纸（380
ꢁ
mm
×
255 mm），叠放入发芽盒（盘）（450 mm
×
300 mm
×
90 mm）内，加入蒸馏水，充分润湿，用无菌纱布轻拭床面，除去余液和纸间气泡后，置种板辅助平行置种，纸边距2
ꢁ
cm～2.5
ꢁ
cm。种子置床后，加盖1张润湿的发芽纸，盖上发芽盒（盘）盖，贴好标签并标注品种名称、样品编号、重复次数、置床时间等基本信息，放入人工气候箱中进行发芽。
41.卷纸发芽：用75
ꢁ
%的酒精溶液消毒操作台，将2张发芽纸（380
ꢁ
mm
×
255 mm）叠放好，用油性记号笔在发芽纸一角较小区域标识样品信息（或备样品信息防水条），如：样品名称、重复编号等。发芽纸用蒸馏水充分润湿，用无菌纱布轻拭床面，除去余液和纸间气泡后，置种板辅助交错置种，种孔朝向一致，纸边距5 cm。种子置床后加盖1张润湿的发芽纸，将纸床（或夹样品信息防水条）卷起，纸卷两端整平，并用皮筋扣住。将纸卷放入自封袋密封好（朝向一致），在自封袋上粘贴标签纸或用油性记号笔标识相关信息后，垂直放入人工气候箱（纸卷种孔端朝下），进行发芽。
42.（2）孔端组织切割：从发芽纸中取出待测种子（根据研究需求选着特定状态的种子），用手术刀对种子进行横切（见图2），保留孔端（含完整的胚根鞘组织），弃后端；切割后将孔端置于湿润的滤纸上备用。
43.（3）根鞘组织分离：根据玉米品种特性及待测样胚根鞘的直径选择相应规格的玻璃转管，并将其安置在根鞘分离器中（根鞘分离器具体结构及使用方法见下文），通过旋转将胚根与胚根鞘分离，并移出胚根，使用前玻璃转管口稍蘸润滑剂（液体石蜡），特别是种子萌发初期阶段根鞘衔接紧密需缓慢转动向前推进，分离后的样品如图3所示。
44.（4）胚根鞘的分取：将胚根从胚根鞘中移出后，在体视镜下用手术刀和镊子等将孔端组织中胚根鞘完整剥离出来，剥离期间用滴管在剥离处用无菌水润湿，方便剥离，避免胚根鞘完整性受到机械破坏。
45.（5）待测样的固定：将处理好的胚根鞘样品移放在特制的组织样品承载体（图7）上。组织样品承载体包括基于3d打印技术加工制作出透明模块42和垫片40，透明模块42上固定有垫片40，胚根鞘样品通过垫片孔41和透明模块42顶部的置样孔43固定好，待测。
46.（6）穿刺力的测定：将组织样品承载体固定在载样台上（见图8），测定前在垫片40上加滴少量无菌水，保证样品湿润，然后利用种子生物力测定系统（见图8）进行胚根鞘样品穿刺力测定，即金属探针38（特定规格）依次通过垫片孔41、置样孔43、胚根鞘39、出针孔44；测量参数为：探针直径0.5mm、移动速度30mm
∙
min-1
，环境温度15-20℃，完成时间30min内；样品测定结束后，清理组织样品承载体、卸载探针、各系统部件回归原位。
47.（7）信息存储分析：将种子生物力测定系统对玉米胚根鞘穿刺力信息进行存储（包括案例穿刺力曲线见图9）并导出导出目标信息数据进行统计分析。
48.所述作业（3）中，一种玉米根鞘分离器（见图3-图5）包括分离器转头4、微型电钻25、玻璃转管10。其中分离器转头4包括分离器帽1、连帽轴2、连帽轴螺纹3、分离器转头4、连尾轴5、分离器尾6、分离器尾防滑纹7、电钻固定轴8、玻璃转管伸缩控制按钮9、玻璃转管套11、分离器帽内腔12、分离器帽内腔螺纹13、连尾轴螺纹14、分离器尾内腔15、分离器尾内腔螺纹16、电钻固定轴卡条17、橡胶圈18、分离器转头内槽19、稳管器20、稳管套21、缩压帽22、弹簧23、稳管器卡头24；微型电钻25包括转头固定夹26、转头固定器27、松紧环28、松紧环防滑纹29、变速控制器30、电源开关31、电钻固定卡口32、电池33、电池防滑纹34、充电口35、充电头36、电源线37。
49.所述的分离器转头4的前部为分离器帽1，后部为电钻固定轴8；将分离器帽1的分离器帽内腔15对准连帽轴2，利用分离器帽内腔螺纹13和连帽轴螺纹3将分离器帽1进行旋转固定，连尾轴5利用连尾轴螺纹14与分离器尾内腔15内的分离器尾内腔螺纹16进行旋转固定。
50.所述的分离器转头4的分离器帽1前端有玻璃转管套11，内部有橡胶圈18（在玻璃转管套11后部起到固定玻璃转管10），稳管器卡头24卡在分离器转头内槽19中用于固定稳管器20，稳管套21套在缩压帽22上，当弹簧23伸长稳管套21将缩压帽22压紧，弹簧23受玻璃转管伸缩控制按钮9控制通过压伸控制固定玻璃转管10前端长度，且玻璃转管伸缩控制按钮9可取下；后部有电钻固定轴8，其上有电钻固定轴卡条17可与微型电钻25的转头固定夹26紧密固定。
51.所述的微型电钻25前为转头固定器27，转头固定器27顶部为转头固定夹26，后部为松紧环28，通过松紧环防滑纹29旋转松紧环28使转头固定夹26打开或关闭，方便安装和卸去分离器转头4；中部除了有电源开关31控制微型电钻25工作与否外，还有变速控制器30通过推动及按压力度控制转头固定夹26旋转方向及速度，此外中部还有2个电钻固定卡口32，根据需要可将微型电钻25固定在特定的电钻架上；后部是电池33，上有电池防滑纹34可方便电池33卸载，电池33底部有充电口35，充电头36插入充电口35，电源线37接通电源即可为电池33充电。
52.所述的玻璃转管10可通过取下玻璃转管伸缩控制按钮9，放入固定稳管器20中，或从玻璃转管套11端直接放入。
53.综上所述，本发明能够为玉米种子胚根鞘弱化提供直接生物力学（穿刺力）证据。
54.最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的设计精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。