一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种一步诱导艾纳香根细胞 分化产生不定芽的培养方法。


背景技术：

2.艾纳香(blumea balsamifera(l.)dc.)是菊科艾纳香属多年生草本植物，分 布于我国云南、贵州、海南、中国台湾等地，是中药艾片(左旋龙脑)的唯一 来源植物，其提取物是多种中成药的主要原料，并广泛应用于食品、药妆等市 场领域，具有良好的市场前景。
3.长期以来，艾纳香种植技术相对落后，在生产上以种子繁殖和分根繁殖为 主。种子繁殖属于有性繁殖，缺点在于出苗率低，且后代性状分离，无法保持 原有种性；分根繁殖属于无性繁殖，缺点在于无法排除原有植株的病原体，且 效率低下；良种种苗扩繁是艾纳香种植技术的主要难点。因此，有必要开展艾 纳香种苗的离体扩繁研究。
4.前人对艾纳香离体快繁开展了多种技术尝试，其中包含诱导腋芽增殖、诱 导叶片外植体先产生愈伤组织，再诱导愈伤组织分化得到不定芽等技术，如专 利cn102550421a《馥芳艾纳香种苗快速繁育与栽培方法》公开了利用艾纳香腋 芽茎段作为外植体诱导丛生芽的培养方法，如专利cn103250645a《滇桂艾纳香 药材的快速繁殖方法》公开了利用艾纳香的茎尖、嫩茎、老茎、叶片、花苞和 种子进行愈伤组织的诱导，再进行试管苗的诱导的培养方法。但是，这些技术 难以满足目前艾纳香的育种需求。
5.首先，诱导腋芽增殖是最常用的艾纳香种苗快繁技术，其通过刺激植株原 有的侧芽生长点生长，达到扩繁的目的，不涉及细胞脱分化过程。如果试图用 此方式进行人工诱变或转基因，得到嵌合体的几率会很高，因为，构成原有的 芽的复数细胞很难全部变异或得到转化，两种细胞将混杂在一起，从而产生嵌 合体。嵌合体在生长过程中，会发生性状不稳定和性状消失的问题，导致育种 工作失败。
6.较新的技术是使用叶片外植体，先使用一种培养基诱导产生愈伤组织，然 后再转移到另一种培养基，诱导愈伤组织分化形成不定芽。通常人工诱变在愈 伤组织阶段进行，但由于部分未成功诱变的细胞同样可能分化形成不定芽，因 此该过程同样存在嵌合体的问题。此外，这种技术需要经过两个步骤，配制至 少两种培养基，接种至少两次，培养至少两个阶段，因此不仅过程繁琐，而且 还存在一定几率、偶发于愈伤组织阶段的非目的性变异，干扰诱变或遗传转化 结果。
7.鉴于此，目前仍缺乏一种不会产生嵌合体，且过程简便的一步获得艾纳香 不定芽的组织培养方法。


技术实现要素：

8.鉴以此，本发明提出一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方 法，不需要诱导外植体脱分化形成愈伤组织后再分化形成不定芽，而是由体细 胞直接分化为不定芽，减少了嵌合体的产生，为艾纳香人工诱变、转基因等育 种工作提供技术基础。
9.本发明的技术方案是这样实现的：
10.一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法，包括以下步骤：
11.s1.切取艾纳香的根，再将根切段，消毒，得根段；
12.s2.配制不定芽诱导培养基，所述不定芽诱导培养基包括：0.01～0.5mg/l naa、0～1.0mg/l 6-ba、10～70g/l蔗糖和2～8g/l琼脂和基础培养基；
13.s3.诱导不定芽：将步骤s1的根段接入步骤s2配制的不定芽诱导培养基中 进行培养，得艾纳香不定芽。
14.优选的，所述根段为主根或侧根，根段的长度为1～25cm。
15.优选的，所述根段的长度为3～4cm；根段长度偏短，诱导产生不定芽的效 率会较低；长度太长，根段培养材料的数量偏少，造成根段资源的浪费；在长 度为3～4cm，诱导产生不定芽的效率高，且能够获得更多根段培养材料，充分 利用了艾纳香根。
16.优选的，所述不定芽诱导培养基为在基础培养基中加入0.025～0.1mg/l naa、1mg/l 6-ba、10～70g/l蔗糖和2～8g/l琼脂。
17.优选的，所述不定芽诱导培养基还包括：0～100mg/l维生素c和0～100mg/l 聚乙烯吡咯烷酮。
18.优选的，所述不定芽诱导培养基为在基础培养基中加入0.025～0.1mg/l naa、1mg/l 6-ba、10～70g/l蔗糖、2～8g/l琼脂、0.01～10mg/l维生素c和 0.01～10mg/l聚乙烯吡咯烷酮。
19.优选的，所述不定芽诱导培养基为在基础培养基中加入0.05mg/l naa、0.1 mg/l 6-ba、30g/l蔗糖和2～8g/l琼脂。
20.优选的，所述不定芽诱导培养基为在基础培养基中加入0.05mg/l naa、1 mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、6g/l琼脂、10mg/l维生素c和10mg/l聚乙烯吡咯烷 酮。
21.优选的，所述培养的条件为25～28℃。
22.优选的，所述培养的时间为10～90天，最佳培养的时间为20天。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24.(1)本发明提供一种用艾纳香的根作为外植体材料，一步诱导根细胞直接 分化产生不定芽的培养方法，填补了艾纳香的根作为外植体材料的空白，增加 了可培养的外植体材料对象，即增加了艾纳香在扩繁增殖过程中有效外植体来 源，而且使用艾纳香的根作为外植体的培养效果更佳，克服了选择带芽茎段或 叶片作为外植体，通过增殖或愈伤组织再生不定芽的不足。
25.(2)本发明的培养方法，针对艾纳香根设计了不定芽诱导培养基，可以使 艾纳香根细胞直接分化形成不定芽，不必经过形成愈伤组织的环节，比现有技 术更简便快捷，且可以降低后期生物技术育种所产生的嵌合体。
26.(3)本发明节省了耗材、时间和人力成本，并提高了艾纳香定向诱变或遗 传转化的准确性，为艾纳香人工诱变、细胞工程育种提供技术基础。
附图说明
27.图1为本发明艾纳香根段外植体直接分化的不定芽；
具体实施方式
28.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步 的说明。本发明所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
29.本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
30.本发明所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试 剂和材料。
31.本发明所使用的无菌苗均来源于2019年9月～2020年10月份在海南省儋州 市热带作物科学院品种资源研究所南药组培室中所培育的艾纳香组培苗。
32.实施例中有效根段数指的是未污染的根段。
33.诱导率是指接种30d后成功诱导根段分化形成的不定芽总数占外植体总数 的百分比，计算公式为诱导率(％)＝不定芽总数
÷
外植体总数
×
100。
34.实施例1
35.一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法，包括以下步骤：
36.s1.取艾纳香无菌实生苗，取主根和侧根，将根切段，每段长1～4cm，消毒， 得根段；所述艾纳香无菌实生苗为将健康艾纳香种子进行常规灭菌后进行无菌 播种，培养12天所得；所述无菌播种培养基为以1/2ms为基础培养基，在基 础培养基中，加入0.01～0.5mg/l naa、20～50g/l蔗糖和3～7g/l琼脂；
37.s2.以ms为基础培养基，在基础培养基中加入0.05mg/l naa、0.1mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、6g/l琼脂、10mg/l维生素c和10mg/l聚乙烯吡咯烷酮， 得不定芽诱导培养基；
38.s3.将步骤s1的根段接种到步骤s2配制的不定芽诱导培养基中，在 25～28℃培养20天，利用不定芽诱导培养基培养分段的根得到不定芽。
39.实施例2
40.一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法，包括以下步骤：
41.s1.选择健康无病虫害植株，对土壤进行灌根消毒3天后，不破坏根表皮的 情况下挖取艾纳香根部组织，用毛笔小心去除表面土壤颗粒，自来水冲洗3遍、 无菌水冲洗3遍，在超净台中进行常规灭菌后，将根分段，每段长3～6cm
42.s2.以1/2ms为基础培养基，在基础培养基中加入0.025mg/l naa、0.1mg/l 6-ba、10g/l蔗糖和6g/l琼脂，得不定芽诱导培养基；
43.s3.将步骤s1的根段接种到步骤s2配制的不定芽诱导培养基中，在 25～28℃培养20天，利用不定芽诱导培养基培养分段的根部组织得到不定芽。
44.实施例3
45.一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法，包括以下步骤：
46.s1.取艾纳香不定根分段，每段长25cm，消毒，得根段；所述不定根为将 外植体接种到不定根诱导培养基中分化培养30天所得；所述不定根诱导培养基 以1/2ms为基础培养基，在基础培养基中，加入0.01～0.5mg/l naa、20～50g/l 蔗糖和3～7g/l琼脂；
47.s2.配制不定芽诱导培养基以ms为基础培养基，在基础培养基中加入 0.1mg/l naa、2.0mg/l 6-ba、70g/l蔗糖、8g/l琼脂、10mg/l维生素c和 10mg/l聚乙烯吡咯烷酮；
48.s3.将步骤s1的根段接种到步骤s2配制的不定芽诱导培养基中，在 25～28℃培养90天，利用不定芽诱导培养基培养分段的不定根得到不定芽。
49.对比例1
50.一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法，包括以下步骤：
51.s1.取艾纳香无菌实生苗，取带芽茎段，消毒；所述艾纳香无菌实生苗为将 健康艾纳香种子进行常规灭菌后进行无菌播种，培养12天所得；所述无菌播种 培养基为以1/2ms为基础培养基，在基础培养基中，加入0.01～0.5mg/l naa、 20～50g/l蔗糖和3～7g/l琼脂；
52.s2.以ms为基础培养基，在基础培养基中加入0.05mg/l naa、0.1mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、6g/l琼脂、10mg/l维生素c和10mg/l聚乙烯吡咯烷酮， 得不定芽诱导培养基；
53.s3.将步骤s1的带芽茎段接种到步骤s2配制的不定芽诱导培养基中，在 25～28℃培养20天，利用不定芽诱导培养基培养带芽茎段得到不定芽。
54.对比例2
55.一种一步诱导艾纳香根细胞分化产生不定芽的培养方法，包括以下步骤：
56.s1.取艾纳香无菌实生苗，摘取叶片，消毒；所述艾纳香无菌实生苗为将健 康艾纳香种子进行常规灭菌后进行无菌播种，培养12天所得；所述无菌播种培 养基为以1/2ms为基础培养基，在基础培养基中，加入0.01～0.5mg/l naa、 20～50g/l蔗糖和3～7g/l琼脂；
57.s2.以ms为基础培养基，在基础培养基中加入0.05mg/l naa、0.1mg/l 6-ba、30g/l蔗糖、6g/l琼脂、10mg/l维生素c和10mg/l聚乙烯吡咯烷酮， 得不定芽诱导培养基；
58.s3.将步骤s1的叶片接种到步骤s2配制的不定芽诱导培养基中，在 25～28℃培养20天，利用不定芽诱导培养基培养叶片，未得到不定芽。
59.统计实施例1～3和对比例1～2诱导培养后的不定芽数，计算不定芽诱导率， 结果见表1：
60.表1不定芽诱导效果
[0061][0062]
结果表明，本发明使用根段进行不定芽诱导的，不定芽诱导率高，诱导效 果优于带芽茎段和叶片。
[0063]
实施例4不同6-ba浓度对艾纳香根细胞脱分化产生不定芽的影响
[0064]
实验方法：以ms为基本培养基，添加0.05mg/l naa、30g/l蔗糖、2～8g/l 琼脂、10mg/l维生素c和10mg/l聚乙烯吡咯烷酮；再分别添加不同浓度的 6-ba，分别是0mg/l，1.0mg/l，1.5mg/l，2.0mg/l，以0mg/l为对照组，并分 别配制成培养基，接种分段的根部组织(根段长约3.0～4.0cm)，30d后排除 被污染的根外植体后统计不定芽发生数，计算诱导
率。
[0065]
表2不同6-ba浓度对艾纳香根细胞脱分化产生不定芽的影响
[0066]
6-ba浓度(mg/l)诱导率(％)064.61.077.51.555.02.041.7
[0067]
结果如表2所示，当6-ba浓度为1.0mg/l的时候，单位根段出芽数最多， 诱导艾纳香根外植体体细胞脱分化出不定芽的效果最佳。当6-ba浓度为1.5 mg/l时，单位根段出芽数55.0％，而当6-ba浓度为2.0mg/l时，单位根段出芽 数降至41.7％，均低于对照组。
[0068]
实施例5不同naa浓度对艾纳香根细胞脱分化产生不定芽的影响
[0069]
实验方法：设置不同浓度naa的激素添加量，以ms为基础培养基，添加 1.0mg/l的6-ba、30g/l蔗糖、2～8g/l琼脂、10mg/l维生素c和10mg/l聚乙 烯吡咯烷酮，再添加不同浓度的naa溶液，分别是0mg/l，0.025mg/l，0.05mg/l， 0.075mg/l，0.1mg/l，以0mg/l为对照组，并分别配制成培养基，接入分段的根 部组织(根段长约3.0～4.0cm)，30d后排除被污染的根外植体，统计不定芽发 生数，并计算诱导率。
[0070]
表3不同naa浓度对艾纳香根细胞脱分化产生不定芽的影响
[0071]
naa浓度(mg/l)诱导率(％)045.00.02557.50.0582.50.07555.00.147.5
[0072]
结果如表3所示，当naa浓度为0.05mg/l时，单位根段出芽数最多，诱 导不定芽再生的效果最佳。从总体来看，5种naa浓度以0.05mg/l为临界点， 当naa浓度低于0.05mg/l时，获得不定芽总数随naa浓度的增长而增多，说 明此时naa对不定芽分化起促进作用且效果逐渐增强；当naa浓度高于0.05 mg/l时，获得不定芽总数随naa浓度的增长而减少，而且naa浓度添加浓度 为0.025～0.1mg/l，单位根段出芽数均高于对照组，说明naa与本技术培养基 中的其他成分合用，可以提高诱导不定芽再生的效果。
[0073]
实施例6不同ms培养基条件对艾纳香根细胞脱分化产生不定芽的影响
[0074]
实验方法：设置3个等级的ms培养基，分别是ms、1/2ms、3/4ms，并 添加0.05mg/l naa、1.0mg/l的6-ba、30g/l蔗糖、2～8g/l琼脂、10mg/l维 生素c和10mg/l聚乙烯吡咯烷酮，分别配制成培养基，接入分段的根部组织(根 段长约3.0～4.0cm)，30d后统计不定芽发生数，并计算诱导率。
[0075]
表4不同ms培养基条件对艾纳香根细胞脱分化产生不定芽的影响
[0076]
基础培养基诱导率(％)1/2ms47.53/4ms60.4
ms90.0
[0077]
结果如表4所示，本发明以ms作为基本培养基，有效单位根段出芽数最 多，诱导根外植体脱分化产生不定芽的效果佳，且诱导率显著高于1/2ms和 3/4ms基本培养基。
[0078]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。