具有人源化CXCL13基因的非人动物的制作方法

背景技术：

1、包含啮齿动物的非人动物已被用作人类细胞(如人类造血干细胞)或患者源性异种移植组织或细胞的接受者。需要支持和促进移植的人类细胞的存活和增殖的经改进的非人动物系统，所述非人动物系统将促进更好地理解相关疾病的发病机制和治疗剂的发展。

技术实现思路

1、根据本公开已经证实，啮齿动物内源性cxcl13基因的人源化使得啮齿动物支持如慢性淋巴细胞白血病细胞等人类细胞的更好移植和增殖。因此，本文公开了cxcl13人源化啮齿动物、用于制备此类啮齿动物的组合物和方法以及使用此类啮齿动物测试候选治疗剂(例如，候选抗癌药物)的方法。

2、一方面，本文公开了一种经基因修饰的啮齿动物，其包括在其基因组中的包括啮齿动物cxcl13核酸序列和人cxcl13核酸序列的人源化cxcl13基因，其中所述人源化cxcl13基因编码人源化cxcl13多肽。

3、在一些实施例中，所述人源化cxcl13多肽包括与人cxcl13蛋白的趋化因子il-8样结构域基本上相同的所述趋化因子il-8样结构域。在一些实施例中，所述人源化cxcl13多肽包括与所述人cxcl13蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的所述成熟蛋白序列。在一些实施例中，所述人cxcl13蛋白包括seq id no:2的氨基酸序列。

4、在一些实施例中，所述人源化cxcl13多肽包括啮齿动物信号肽。在一些此类实施例中，所述啮齿动物信号肽是内源性啮齿动物cxcl13蛋白的所述信号肽。

5、在一些实施例中，人源化cxcl13基因中的所述人cxcl13核酸序列编码与人cxcl13蛋白的所述趋化因子il-8样结构域基本上相同的多肽。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3-4。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列编码与人cxcl13蛋白的所述成熟蛋白序列基本上相同的多肽。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3、外显子4以及外显子5的编码部分。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3、外显子4和外显子5。

6、在一些实施例中，人源化cxcl13基因中的所述啮齿动物cxcl13核酸序列包括啮齿动物cxcl13基因的外显子1。在一些实施例中，所述啮齿动物cxcl13基因是内源性cxcl13基因。

7、在一些实施例中，所述人源化cxcl13基因包括啮齿动物cxcl13基因的外显子1和人cxcl13基因的外显子3-5。

8、在一些实施例中，所述人源化cxcl13基因可操作地连接到啮齿动物cxcl13启动子。在一些实施例中，所述啮齿动物cxcl13启动子是内源性啮齿动物cxcl13基因座处的内源性啮齿动物cxcl13启动子。在其它实施例中，所述人源化cxcl13基因可操作地连接到人cxcl13启动子，所述人cxcl13启动子任选地位于所述内源性啮齿动物cxcl13基因座。

9、在一些实施例中，所述人源化cxcl13基因位于除内源性啮齿动物cxcl13基因座之外的基因座。在一些实施例中，所述人源化cxcl13基因位于内源性啮齿动物cxcl13基因座；并且在一些此类实施例中，所述人源化cxcl13基因可能由于内源性啮齿动物cxcl13基因座处的啮齿动物cxcl13基因组dna被人cxcl13核酸置换而形成。在一些实施例中，所述人源化cxcl13基因是由于包括所述内源性啮齿动物cxcl13基因座处的所述啮齿动物cxcl13基因的外显子2-3以及外显子4的编码部分的啮齿动物基因组dna被人cxcl13基因的外显子3-5置换而形成的。

10、在一些实施例中，本文公开的所述啮齿动物对人源化cxcl13基因是杂合的。在一些实施例中，本文公开的所述啮齿动物对人源化cxcl13基因是纯合的。

11、在一些实施例中，本文公开的啮齿动物的基因组可以进一步包括内源性啮齿动物sirpα基因座处的人源化sirpα基因、内源性啮齿动物baff基因座处的人源化baff基因、内源性啮齿动物april基因座处的人源化april基因、内源性啮齿动物il-6基因座处的人源化il-6基因或其组合。

12、在一些实施例中，本文公开的所述啮齿动物是免疫缺陷的，如rag2和il-2rg双敲除啮齿动物。

13、在一些实施例中，本文公开的所述啮齿动物选自小鼠或大鼠。

14、另一方面，本文公开了一种分离的啮齿动物组织或细胞，其基因组包括本文所描述的人源化cxcl13基因。在一些实施例中，所述分离的啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。还公开了一种包括啮齿动物胚胎干细胞的啮齿动物胚胎。

15、在另外的方面，本文公开了一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括：修饰啮齿动物基因组以包括人源化cxcl13基因，其中所述人源化cxcl13基因包括啮齿动物cxcl13核酸序列和人cxcl13核酸序列并且编码人源化cxcl13多肽，所述人源化cxcl13多肽包括与人cxcl13蛋白的趋化因子il-8样结构域基本上相同的所述趋化因子il-8样结构域；以及制备包括经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。

16、在一些实施例中，通过以下修饰啮齿动物基因组：将包括人cxcl13核酸序列的核酸分子引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞的基因组中，从而获得啮齿动物es细胞，其中所述人cxcl13核酸序列已整合到内源性啮齿动物cxcl13基因座中以置换内源性啮齿动物cxcl13基因座处的啮齿动物cxcl13基因组dna，由此形成人源化cxcl13基因；以及使用所获得的啮齿动物es细胞产生啮齿动物。

17、在一些实施例中，被引入到啮齿动物es细胞中的所述人cxcl13核酸序列编码与所述人cxcl13蛋白的所述趋化因子il-8样结构域基本上相同的多肽。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3-4。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列编码与所述人cxcl13蛋白的所述成熟蛋白序列基本上相同的多肽。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3、外显子4以及外显子5的编码部分。在一些实施例中，所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3-5。

18、在一些实施例中，在内源性啮齿动物cxcl13基因座处形成的所述人源化cxcl13基因包括内源性啮齿动物cxcl13基因的外显子1和人cxcl13基因的外显子3-5，所述人cxcl13基因可操作地连接到内源性啮齿动物cxcl13基因座处的内源性啮齿动物cxcl13启动子。

19、另一方面，公开了一种可用于制备经基因修饰的动物的靶向核酸构建体。所述靶向构建体可以包括将整合到内源性啮齿动物cxcl13基因座处的啮齿动物cxcl13基因中的人cxcl13核酸序列，所述人cxcl13核酸序列侧接有与所述内源性啮齿动物cxcl13基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中所述人cxcl13核酸序列整合到所述内源性啮齿动物cxcl13基因中使得啮齿动物cxcl13基因组dna被所述人cxcl13核酸序列置换，由此形成人源化cxcl13基因。在一些实施例中，所述靶向构建体上的所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3-4。在一些实施例中，所述靶向构建体上的所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3、外显子4以及外显子5的编码部分。在一些实施例中，所述靶向构建体上的所述人cxcl13核酸序列包括人cxcl13基因的外显子3-5。

20、在仍另一方面，公开了一种用于测试用于治疗疾病的候选药剂的方法。所述方法包括：将源自患有所述疾病的人类受试者的细胞引入到本文公开的经基因修饰的啮齿动物中；使所述啮齿动物与候选药剂接触；以及测定候选药剂在减少或消除所述细胞方面是否有效。有效减少或消除来自所述啮齿动物的所述细胞的候选药剂被认为对治疗所述疾病有用。

21、在一些实施例中，所述疾病是癌症，例如实体瘤或血癌。在一些实施例中，所述疾病是白血病。

22、在一些实施例中，候选药剂是抗癌化合物，所述抗癌化合物任选地选自小分子化合物、核酸分子(例如，sirna)或抗体。