抗原特异性抗体的鉴定和产生的制作方法

发明领域提供了用于获得编码对抗原具有特异性的抗体氨基酸序列，例如可变结构域氨基酸序列的核酸的方法。公开了如下方法，其包括从进行免疫接种的宿主获得编码来自第一样品的抗体序列和来自第二样品的针对所关注抗原的多种抗体的核酸序列，以获得编码对抗原具有特异性的人免疫球蛋白可变结构域或其部分的核苷酸序列。还公开了制造针对所关注抗原的抗体的方法。

背景技术：

1、抗体通常包含重链组分，其中每个重链单体与轻链缔合，这些链的可变结构域组合形成抗原结合位点。抗体，尤其是单克隆抗体，在诊断和治疗中具有广泛的用途。

2、两种传统的方法已用于制备单克隆抗体：杂交瘤技术和dna展示(例如，在噬菌体、酵母或细菌系统中)。在杂交瘤技术中，来自免疫动物的b细胞通常与骨髓瘤细胞系融合，产生分泌抗原的杂交瘤系。分离产生所关注的单克隆抗体的细胞，在培养物中生长，并纯化所得到的所需抗体。高质量的纯化对于去除污染物来说至关重要。因此，由于杂交瘤培养的生产量有限，故通过杂交瘤技术分离抗体效率不高。

3、展示技术涉及从噬菌体、酵母或哺乳动物文库中产生先导候选抗体。虽然可利用从表达抗体的b细胞中直接分离dna，但dna文库在例如噬菌体、酵母或细菌系统的细胞表达系统中表达，然后“淘选”或滴定以选择具有高亲和力的抗体。展示技术可提供高质量的蛋白质文库，但它们提供的多样性有限。因此，基于体外诱变的亲和力成熟通常是产生源自这类文库的高亲和力抗体的下一步。

4、此外，抗体通常从血浆、血清、腹水、细胞培养基和细菌培养物中表达和分离。这些都是含有大量污染物的来源。因此，从这些来源中有效地纯化抗体是必要的。因此，所属领域仍然需要有效地产生和分离对靶抗原具有必需特异性和结合亲和力的抗体。

技术实现思路

1、本公开尤其描述了使用质谱法(“ms”)与下一代测序(“ngs”)的组合获得抗体的方法。还公开了制备抗体的方法。

2、所提供的方法能够有效地鉴定和/或选择抗体、尤其是来自已经用所关注的抗原进行免疫接种的宿主(例如，基因修饰的非人类动物，例如啮齿动物)的抗体的人免疫球蛋白可变结构域序列和/或互补决定区(cdr)序列。在一些实施方案中，所提供的方法包括将宿主的多个抗体序列(例如，由ngs产生的抗体序列的文库)与和/或针对来自宿主的抗体肽的ms分析进行比较和/或询问的步骤。如本文使用的“数据库”可以是示例性“文库”。

3、在一些实施方案中，所提供的方法包括从用所关注的抗原进行免疫接种的宿主(例如从非人类动物，例如啮齿动物的b细胞)获得和/或产生多个免疫球蛋白可变结构域和/或cdr序列(例如文库)。在一些实施方案中，抗体序列的文库包含通过ngs获得的多个核酸序列。在一些实施方案中，抗体序列的文库包含多个cdr3序列。

4、在一些实施方案中，所提供的方法包括对从已经用所关注的抗原进行免疫接种的宿主(例如啮齿动物)获得的抗体样品的ms分析。本公开涵盖如下的认识，即，可在体内和/或离体针对期望特征对用于ms分析的抗体样品进行富集。举例来说，可基于体内定位富集抗体样品。因此，在一些实施方案中，抗体样品可以从宿主内的任何期望来源，例如血清、血浆、淋巴器官、肠、脑脊髓液、脑、脊髓、胎盘或它们的组合获得。在一些实施方案中，可离体针对一种或多种期望特征(例如抗原结合、与细胞的结合等)对抗体样品进行富集。本公开提供了如下的领悟：这类富集与所提供的方法组合使得能够鉴定出通过其它方法难以鉴定的抗体(例如因为以低滴度存在)。在一些实施方案中，本公开提供了一种获得对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或互补决定区(cdr)的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括将来自第一样品的多个人免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列用来自第二样品的抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列进行询问。在一些情况下，进行询问步骤由此获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列。在一些实施方案中，询问包括将抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列相互比对和与多个免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列进行比对。

5、在一些实施方案中，对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr(例如cdr3)是从用特定抗原进行免疫接种的宿主获得的。在一些实施方案中，宿主是基因修饰的非人类哺乳动物。在一些实施方案中，宿主在其基因组，例如其种系基因组中包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含一个或多个人重链v基因区段(又称vh基因区段)、一个或多个人d基因区段(又称人dh基因区段)和一个或多个人重链j基因区段(又称人jh基因区段)。在一些实施方案中，重链可变区可操作地连接于恒定区(例如免疫球蛋白重链恒定区)。

6、在一些实施方案中，宿主在其基因组，例如其种系基因组中包含免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含一个或多个人轻链v基因区段(又称人vl基因区段)和一个或多个人轻链j基因区段(又称人jl基因区段)。在一些实施方案中，轻链可操作地连接于恒定区(例如免疫球蛋白轻链恒定区)。

7、在一些实施方案中，本文所述的方法包括从来自进行免疫接种的宿主的第一样品获得编码多个人免疫球蛋白可变结构域的多个核酸并确定编码的多个免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的方法包括从进行免疫接种的宿主获得包含针对所述抗原的抗体群体的第二样品并从其中确定抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列。

8、在一些实施方案中，宿主是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。

9、在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列(例如cdr3序列)的方法，所述方法包括：(i)获得或确定从样品获得的人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的多个肽序列，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体，和(ii)将人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库用通过ms确定的所述多个肽序列进行询问，其中所述文库包含由所述免疫啮齿动物的b细胞编码的多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列，由此获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列。

10、在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列(例如cdr3序列)的方法，所述方法包括：(i)获得人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库，所述文库包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物的b细胞编码的多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列，和(ii)将所述文库用从样品获得的人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的多个肽序列进行询问，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体。

11、在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含一个或多个人重链v基因区段、一个或多个人d基因区段和一个或多个人重链j基因区段，其中所述重链可变区可操作地连接于恒定区；和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含一个或多个人轻链v基因区段和一个或多个人轻链j基因区段，其中所述轻链可操作地连接于恒定区。

12、在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含有限免疫球蛋白轻链谱系。在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含单个重排人轻链v/j。在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含两个人轻链v基因区段和一个或多个人轻链j区段。

13、在一些实施方案中，免疫啮齿动物产生包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体。在一些实施方案中，免疫啮齿动物不产生单结构域抗体、仅重链抗体和/或纳米抗体。在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含有限免疫球蛋白重链谱系，例如通用重链。

14、在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含ch1缺失修饰。在一些实施方案中，免疫啮齿动物产生单结构域抗体、仅重链抗体和/或纳米抗体。

15、在一些实施方案中，第一样品(即用于序列分析的样品)包含来自初级或次级淋巴器官的b细胞群体，例如来自骨髓样品和/或脾样品的b细胞、来自淋巴结的b细胞、来自培氏斑(peyer’s patches)的b细胞等。在一些实施方案中，从第一样品获得编码多个免疫球蛋白可变结构域的多个核酸序列包括从核酸序列制备cdna并对所述第一样品中的重排重链vdj序列和/或重排轻链vj序列进行测序。在一些实施方案中，从第一样品获得编码多个免疫球蛋白可变结构域的多个核酸序列包括使用dna测序技术，例如下一代dna测序。

16、在一些实施方案中，第二样品(即用于分析肽序列的样品)是或包含任何包含抗体的体液。在一些实施方案中，第二样品是或包含血清、血浆、淋巴器官、肠、脑脊髓液、脑、脊髓、胎盘或它们的组合。在一些实施方案中，第二样品肽序列是经由第二样品中的抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的质谱(ms)分析(例如通过组合液相色谱法与质谱法(lc-ms))获得的。另外，在一些实施方案中，在质谱分析之前，可对抗体群体的重链和/或轻链可变结构域进行蛋白水解消化。

17、在一些实施方案中，可以已针对一种或多种期望特征离体对用于分析肽序列的抗体的样品进行富集(例如在ms分析之前)。在一些实施方案中，获得第二样品还包括使第二样品耗竭不针对特定抗原的抗体。在一些实施方案中，获得第二样品还包括使第二样品富集针对特定抗原的抗体。

18、在一些实施方案中，将来自第一样品的多个免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列用来自第二样品的抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列进行询问包括将抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列与多个免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列进行比对并任选地相互比对。

19、在一些实施方案中，本文所述的方法包括在第二重组抗体中表达所获得的编码人免疫球蛋白可变结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人可变结构域的核苷酸序列可以在与人免疫球蛋白恒定区呈可操作的连接下在细胞系中进行表达。更具体地说，在一些实施方案中，人可变结构域是在与人免疫球蛋白重链恒定区呈可操作的连接下进行表达以产生人免疫球蛋白重链的人重链可变结构域。在一些实施方案中，人免疫球蛋白重链在具有人免疫球蛋白轻链的细胞系中进行表达。在人可变结构域是人轻链可变结构域的实施方案中，其可以在与人免疫球蛋白轻链恒定区呈可操作的连接下进行表达以产生人免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，人免疫球蛋白轻链在具有人免疫球蛋白重链的细胞系中进行表达。

20、在一些实施方案中，本文所述的方法还包括在重组抗原结合蛋白中表达所获得的编码人免疫球蛋白可变结构域的核苷酸序列。

21、在一些实施方案中，重组抗原结合蛋白是人类抗体，例如人类双特异性抗体。

22、在一些实施方案中，对重组抗原结合蛋白进行纯化。在一些实施方案中，测定纯化的重组抗原结合蛋白对特定抗原的亲和力和/或特异性。

23、在一些实施方案中，宿主是基因修饰的小鼠，其在其基因组(例如其种系基因组)中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含一个或多个人重链v基因区段、一个或多个人d基因区段和一个或多个人重链j基因区段，其中所述重链可变区可操作地连接于鼠恒定区；和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包括一个或多个人轻链v基因区段和一个或多个人轻链j基因区段，其中所述轻链可操作地连接于鼠恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链可变区可操作地连接于小鼠重链恒定区，和/或免疫球蛋白轻链可变区可操作地连接于小鼠轻链恒定区。更进一步，免疫球蛋白重链可变区可在内源小鼠重链基因座处可操作地连接于小鼠重链恒定区，和/或可操作地连接于小鼠轻链恒定区的免疫球蛋白轻链可变区处于内源小鼠轻链基因座处。

24、在一些实施方案中，宿主是基因修饰的小鼠，所述基因修饰的小鼠在其基因组中，包括在其种系基因组中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含多个人重链v基因区段、多个人d基因区段和多个人重链j基因区段，其中所述重链可变区可操作地连接于鼠重链恒定区；和可操作地连接于鼠轻链恒定区的免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含仅两个未重排人vκ基因区段和五个未重排人jκ基因区段。在一些实施方案中，仅两个未重排人vκ基因区段是人vκ1-39基因区段和人vκ3-20基因区段。

25、在一些实施方案中，宿主可以是基因修饰的小鼠，其基因组(例如种系基因组)在内源重链基因座处包含：(i)可操作地连接于小鼠重链恒定区的免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含多个未重排人vh基因区段、多个未重排人dh基因区段和多个未重排人jh基因区段；(ii)可操作地连接于小鼠重链恒定区的受限的未重排重链可变区，所述受限的未重排重链可变区包含单个人vh基因区段、一个或多个未重排人dh基因区段和一个或多个未重排人jh基因区段；(iii)通用重链编码序列，所述通用重链编码序列包含可操作地连接于小鼠重链恒定区的单个重排人重链可变区；(iv)可操作地连接于小鼠重链恒定区的经组氨酸修饰的未重排重链可变区，所述经组氨酸修饰的未重排重链可变区包含一个或多个未重排人vh基因区段、一个或多个未重排人dh基因区段和一个或多个未重排人jh基因区段，还包含至少一个组氨酸对非组氨酸残基的取代或插入；(v)仅重链免疫球蛋白编码序列，所述仅重链免疫球蛋白编码序列包含可操作地连接于重链恒定区的免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区包含一个或多个未重排人vh基因区段、一个或多个未重排人dh基因区段和一个或多个未重排人jh基因区段，其中非igm基因，例如igg基因缺乏编码功能性ch1结构域的序列；或(vi)可操作地连接于小鼠免疫球蛋白重链恒定区基因的工程化的内源啮齿动物免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含一个或多个未重排人vl基因区段和一个或多个未重排人jl基因区段。在一些实施方案中，宿主可以是基因修饰的小鼠，其基因组(例如种系基因组)在内源轻链基因座处包含：(i)可操作地连接于小鼠轻链恒定区的免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含多个未重排人vκ基因区段和多个未重排人jκ基因区段；(ii)通用轻链编码序列，所述通用轻链编码序列包含可操作地连接于小鼠轻链恒定区的单个重排人轻链可变区；(iii)可操作地连接于小鼠轻链恒定区的受限的轻链可变区，所述受限的轻链可变区包含两个未重排人vκ基因区段和一个或多个未重排人jκ基因区段；或(iv)可操作地连接于小鼠轻链恒定区的经组氨酸修饰的轻链可变区，所述经组氨酸修饰的轻链可变区包含一个或多个人轻链v基因区段和一个或多个人轻链j基因区段，还包含至少一个组氨酸对非组氨酸残基的取代或插入。

26、在一些实施方案中，宿主包含功能性adam6基因，任选地其中宿主是基因修饰的小鼠并且功能性adam6基因是小鼠adam6基因。在一些实施方案中，宿主可包含和/或表达外源末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)基因。

27、本公开还提供了获得对抗原具有特异性的抗体的免疫球蛋白可变结构域或cdr的方法，所述方法包括：将来自从用抗原进行免疫接种的宿主获得的样品的抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列相对于包含多个人免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列的文库进行询问，由此获得对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列。在一些实施方案中，所述方法包括从用抗原进行免疫接种的宿主获得包含针对抗原的抗体群体的样品。在一些实施方案中，所述方法包括确定抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列。

28、本公开还提供了用于鉴定对特定抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr的方法，所述方法包括：将由多个核酸编码的多个氨基酸序列与包含来自由针对所述抗原的抗体群体产生的轻链和/或重链可变结构域的肽片段的氨基酸序列进行比较，所述多个核酸编码由用所述抗原进行免疫接种的动物产生的多个人免疫球蛋白可变结构域；并且由此鉴定对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列。

29、在一些实施方案中，进行免疫接种的宿主是基因修饰的非人类哺乳动物，所述基因修饰的非人类哺乳动物在其种系基因组中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含一个或多个人重链v基因区段、一个或多个人d基因区段和一个或多个人重链j基因区段；其中所述重链可变区可操作地连接于恒定区；和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含一个或多个人轻链v基因区段和一个或多个人轻链j基因区段；其中所述免疫球蛋白轻链可变区可操作地连接于恒定区。

30、在一些实施方案中，本公开还提供了从用特定抗原进行免疫接种的宿主获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白重链可变结构域或cdr的方法，所述方法包括：获得由从所述宿主获得的多个核酸序列编码的多个人免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列；确定从进行免疫接种的宿主获得的抗体群体的人重链可变结构域的肽序列；将编码的多个人免疫球蛋白重链可变结构域的氨基酸序列用所述抗体群体的人重链可变结构域的肽序列进行询问，由此获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白重链可变结构域或cdr。在一些实施方案中，宿主是基因修饰的小鼠，所述基因修饰的小鼠在其基因组中，包括在其种系基因组中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含多个人重链v基因区段、多个人重链d基因区段和多个人重链j基因区段，其中所述重链可变区可操作地连接于鼠恒定区：和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区是包含单个人轻链v基因区段和单个人轻链j基因区段的单个重排人轻链可变区，其中所述人免疫球蛋白轻链可变区可操作地连接于鼠轻链恒定区。

31、在一些实施方案中，单个重排人轻链可变区是包含单个人轻链vκ基因区段和单个人轻链jκ基因区段的单个重排人κ轻链可变区。在一些实施方案中，单个人轻链vκ基因区段是vκ1-39或vκ3-20基因区段，并且单个人轻链jκ基因区段是jκ1或jκ5基因区段。在一些实施方案中，单个重排人κ轻链可变区包含vκ1-39基因区段和jκ5基因区段。在一些实施方案中，单个重排人κ轻链可变区包含vκ3-20基因区段和jκ1基因区段。

32、在一些实施方案中，鼠轻链恒定区是小鼠κ轻链恒定区。在一些实施方案中，单个重排人轻链可变区可操作地连接于小鼠κ轻链恒定区。在一些实施方案中，单个重排人轻链可变区在内源小鼠κ轻链基因座处可操作地连接于小鼠κ轻链恒定区。

33、在一些实施方案中，宿主包含功能性adam6基因或其片段，任选地其中宿主是基因修饰的小鼠且功能性adam6基因是小鼠adam6基因。

34、在一些实施方案中，第一样品包含来自初级或次级淋巴器官的b细胞群体，例如来自骨髓样品和/或脾样品的b细胞、来自淋巴结的b细胞、来自培氏斑的b细胞等。

35、在一些实施方案中，从第一样品获得编码多个人免疫球蛋白重链可变结构域的多个核酸序列包括从所述核酸序列制备cdna并对所述第一样品中的重排重链vdj序列进行测序。

36、在某些实施方案中，从第一样品获得的编码多个免疫球蛋白可变结构域的多个核酸序列使用dna测序技术来确定。

37、在一些实施方案中，第二样品是或包含任何包含抗体的体液。在一些实施方案中，第二样品是或包含血清、血浆、淋巴器官、肠、脑脊髓液、脑、脊髓或胎盘。在一些实施方案中，确定来自第二样品的肽序列包括对第二样品中的抗体群体的重链可变结构域的质谱，例如包括液相色谱和质谱法(lc-ms)分析。本文所述的方法可包括在质谱分析之前对抗体群体的重链可变结构域进行蛋白水解消化。

38、在一些实施方案中，本文所述的方法包括使第二样品耗竭不针对特定抗原的抗体。在一些实施方案中，本文所述的方法包括使第二样品耗竭针对不同抗原和/或相同抗原(例如用于对宿主进行免疫接种)的不同表位的抗体。在一些实施方案中，本文所述的方法包括使第二样品富集针对所关注的抗原(例如用于对宿主进行免疫接种)的抗体。

39、在一些实施方案中，将多个人免疫球蛋白重链可变结构域的氨基酸序列用抗体群体的人重链可变结构域的肽序列进行询问包括将抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列与多个免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列进行比对并任选地相互比对。

40、在一些实施方案中，本公开提供了鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列(例如cdr3序列)的方法，所述方法包括：(i)获得从样品获得的人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的多个肽序列，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体，和(ii)将人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库用所述多个肽序列进行询问，其中所述文库包含由所述进行免疫接种的啮齿动物的b细胞编码的多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列，由此获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列。

41、在一些实施方案中，本公开提供了鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或cdr序列(例如cdr3序列)的方法，所述方法包括：(i)获得人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库，所述文库包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物的b细胞编码的多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列，和(ii)将所述文库用从样品获得的人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的多个肽序列进行询问，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体。

42、在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含多个人重链v基因区段、多个人d基因区段和多个人重链j基因区段；和包含以下的免疫球蛋白轻链可变区：(i)通用轻链编码序列，所述通用轻链编码序列包含可操作地连接于小鼠轻链恒定区的重排人轻链可变区，所述重排人轻链可变区包含单个人vl基因区段和单个人轻链jl基因区段；(ii)可操作地连接于小鼠轻链恒定区的受限的轻链可变区，所述受限的轻链可变区包含两个未重排人vl基因区段和一个或多个未重排人jl基因区段；或(iii)可操作地连接于小鼠轻链恒定区的经组氨酸修饰的轻链可变区，所述经组氨酸修饰的轻链可变区包含一个或多个人轻链v基因区段和一个或多个人轻链j基因区段，还包含至少一个组氨酸对非组氨酸残基的取代或插入。在一些实施方案中，所提供的方法包括获得人免疫球蛋白重链可变结构域序列的文库，所述文库包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物的b细胞编码的多个人免疫球蛋白重链可变结构域序列，和(ii)将所述文库用从样品获得的人免疫球蛋白重链可变结构域的多个肽序列进行询问，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体。

43、在一些实施方案中，免疫啮齿动物在其种系基因组中包含：可操作地连接于小鼠轻链恒定区的免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含多个未重排人vl基因区段和多个未重排人jl基因区段；和包含以下的免疫球蛋白重链可变区：(i)可操作地连接于小鼠重链恒定区的受限的未重排重链可变区，所述受限的未重排重链可变区包含单个人vh基因区段、一个或多个未重排人dh基因区段和一个或多个未重排人jh基因区段；(ii)通用重链编码序列，所述通用重链编码序列包含可操作地连接于小鼠重链恒定区的单个重排人重链可变区，所述单个重排人重链可变区包含单个人vh基因区段、单个人dh基因区段和单个人jh基因区段；或(iii)可操作地连接于小鼠重链恒定区的经组氨酸修饰的未重排重链可变区，所述经组氨酸修饰的未重排重链可变区包含一个或多个未重排人vh基因区段、一个或多个未重排人dh基因区段和一个或多个未重排人jh基因区段，还包含至少一个组氨酸对非组氨酸残基的取代或插入。在一些实施方案中，所提供的方法包括获得人免疫球蛋白轻链可变结构域序列的文库，所述文库包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物的b细胞编码的多个人免疫球蛋白轻链可变结构域序列，和(ii)将所述文库用从样品获得的人免疫球蛋白轻链可变结构域的多个肽序列进行询问，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体。

44、在一些实施方案中，本文所述的方法可包括获得对所述抗原具有特异性的抗体的人重链可变结构域的核苷酸序列并在抗原结合蛋白中表达所获得的编码人免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是第二(例如重组)抗体。

45、在一些实施方案中，编码人重链可变结构域的核苷酸序列在与人免疫球蛋白重链恒定区呈可操作的连接下在细胞系中进行表达。在一些实施方案中，人免疫球蛋白重链可在具有人免疫球蛋白轻链的细胞系中表达。在一些实施方案中，人免疫球蛋白轻链可源自与所述小鼠中所存在相同的单个重排可变区序列或其体细胞突变型式。

46、在一些实施方案中，本文所述的方法包括在重组抗原结合蛋白中表达所获得的编码人免疫球蛋白可变结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组抗原结合蛋白是第二重组抗体。在一些实施方案中，第二抗体是人类抗体且可以是双特异性抗体。可对第二抗体进行纯化并确定纯化的第二抗体对特定抗原的亲和力和/或特异性。

47、在一些实施方案中，用于确定重链和/或轻链可变结构域的肽序列的样品是或包含任何包含抗体的体液。在一些实施方案中，第二样品是或包含血清、血浆、淋巴器官、肠、脑脊髓液、脑、脊髓或胎盘或它们的组合。在一些实施方案中，确定重链和/或轻链可变结构域的肽序列包括进行ms分析(例如lc/ms分析)。在一些实施方案中，确定重链和/或轻链可变结构域的肽序列包括对包含从用抗原进行免疫接种的宿主获得的抗体的样品进行ms分析(例如lc/ms分析)。

48、在一些实施方案中，包含多个人免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列的文库由从用抗原进行免疫接种的宿主获得的多个核酸编码。在一些实施方案中，包含多个人免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列的文库由从b细胞样品，例如骨髓和/或脾样品获得的多个核酸编码。

49、从以下详细描述中，结合随附权利要求书，将更完全地了解本公开中所提供的这些和其它特征和优点。应注意，权利要求书的范围由其中的叙述界定，而非由本说明书中所阐述的特征和优点的特定论述界定。