微生物群落中微生物的控制的制作方法

微生物群落中微生物的控制
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3.微生物有机体如细菌可影响人类和动物健康，并参与与多种动物器官和组织相关的微生物群。微生物有机体介导的过程可用于多种工业过程中以生产目的产物，例如用于原料中的发酵。另外，微生物有机体可用于在无菌环境中制造产品，如在药物、生物制剂和化妆品的制造中。
4.调节微生物有机体的种群，例如以减少或消除不期望的微生物有机体，对于维持工业过程和维持包含微生物有机体的组织的健康是有用的。抗微生物肽如细菌素可影响微生物有机体的生长或活力。领域
5.一些实施方案涉及在微生物群落中生产抗微生物肽。可以将编码抗微生物肽的核酸原位施用至微生物群落中的微生物有机体，如微生物组。概述
6.在一些实施方案中，描述了在微生物群落中原位生产分泌的抗微生物肽的方法(为了简明起见，也称为“生产方法”)。生产方法可以包括将期望的微生物有机体鉴定为微生物群落的成员。生产方法可以包括将核酸原位施用至微生物群落的至少一种期望的微生物有机体，其中核酸编码抗微生物肽，所述抗微生物肽不杀死所鉴定的期望的微生物有机体或不阻止所鉴定的期望的微生物有机体的繁殖。因此，至少一种期望的微生物有机体被遗传修饰以表达抗微生物肽。生产方法还可以包括允许遗传修饰的期望的微生物有机体在微生物群落中生长，由此遗传修饰的期望的微生物有机体分泌抗微生物肽。在一些实施方案的生产方法中，从所述施用到所述允许遗传修饰的期望的微生物有机体生长，所述期望的微生物有机体彼此之间的比例基本上保持不变。在一些实施方案的生产方法中，没有将编码抗微生物肽的免疫调节剂的核酸施用至所述至少一种期望的微生物有机体。在一些实施方案的生产方法中，在所述分泌之前，所述微生物群落被一种或多种未知身份的不期望的微生物有机体污染。在一些实施方案的生产方法中，抗微生物肽杀死所述一种或多种不期望的微生物有机体或者阻止所述一种或多种不期望的微生物有机体的繁殖。在一些实施方案的生产方法中，抗微生物肽不被所述遗传修饰的期望的微生物有机体物种的野生型基因组编码。在一些实施方案的生产方法中，所述抗微生物肽是所述遗传修饰的微生物有机体外源的，或者其中所述抗微生物肽是合成的。在一些实施方案的生产方法中，所述核酸编码两种或更多种不同的抗微生物肽，因此所述遗传修饰的期望微生物细胞表达两种或更多种不同的抗微生物肽。在一些实施方案的生产方法中，施用所述核酸包括施用编码不同抗
微生物肽的两种或更多种不同的核酸。在一些实施方案的生产方法中，一起选择所述不同的抗微生物肽以靶向抗生素抗性感染。在一些实施方案的生产方法中，施用所述核酸包括施用包含所述核酸的质粒；和/或施用包含所述核酸的噬菌体。在一些实施方案的生产方法中，期望的微生物有机体包括微生物有机体的两种或更多种不同物种，其中将所述核酸施用至所述不同物种中的仅一种或多于一种。在一些实施方案中，生产方法还包括将不同的核酸原位施用至所述微生物群落中不同于所述基因工程化的微生物有机体的微生物有机体，并且所述不同的核酸编码与所述核酸不同的抗微生物肽(因此，所述不同的微生物有机体被遗传修饰以表达所述不同的抗微生物肽)。在一些实施方案的生产方法中，所述不同的核酸与所述核酸同时施用。在一些实施方案的生产方法中，在与所述核酸不同的时间施用所述不同的核酸。在一些实施方案的生产方法中，所述微生物群落由微生物组组成。例如，所述微生物组可以是选自以下的微生物组：胃肠道、皮肤、乳腺、胎盘、生物流体、精液、子宫、阴道、卵泡、肺、唾液、口腔、粘膜、结膜、胆道和土壤，或者两种或更多种所列项目的组合。例如，可以将核酸施用至对象体内期望的微生物细胞。在一些实施方案的生产方法中，微生物群落是对象自体的，并且离体施用所述核酸。所述方法还可以包括将包含所述遗传修饰的期望的微生物有机体的微生物群落施用至所述对象。例如，微生物群落可以使对象的组织或器官的微生物组聚居(populate)或再聚居(repopulate)。在一些实施方案的生产方法中，所述微生物群落是保存的健康样品，并且其中在施用时，所述对象患有所述对象的微生物组的失调。在一些实施方案的生产方法中，所述微生物群落由工业培养物组成。
7.在一些实施方案中，描述了微生物群落。所述微生物群落可以包含期望的微生物有机体，其中所述期望的微生物有机体中的至少一种是遗传修饰的。所述遗传修饰的期望的微生物有机体可以包含编码不靶向期望的微生物有机体的第一抗微生物肽的第一核酸。因此，所述遗传修饰的期望微生物可经配置以表达第一抗微生物肽。所述第一核酸还可以编码所述第一抗微生物肽框内的分泌信号，例如本文所述，使得所述抗微生物肽在表达时可包含分泌信号。所述微生物群落还可以包含与所述第一核酸具有相同序列的无细胞的第二核酸。无细胞的第二核酸可以指示，例如，将第一核酸原位施用至遗传修饰的期望的微生物有机体。在一些实施方案的微生物群落中，所述第一抗微生物肽不被所述遗传修饰的期望的微生物有机体物种的野生型基因组编码。在一些实施方案的微生物群落中，所述第一抗微生物肽是合成的。在一些实施方案的微生物群落中，所述第一抗微生物肽是遗传修饰的微生物有机体外源的。在一些实施方案的微生物群落中，所述期望的微生物有机体不包含所述抗微生物肽的免疫调节剂。在一些实施方案的微生物群落中，微生物群落被一种或多种未知身份的不期望的微生物有机体污染。在一些实施方案的微生物群落中，所述第一核酸编码两种或更多种不同的抗微生物肽。在一些实施方案的微生物群落中，所述遗传修饰的微生物有机体还包含编码不靶向所述一种或多种期望的微生物有机体的第二抗微生物肽的第三核酸。所述第三核酸还可以包含所述第二抗微生物肽框内的分泌信号。在一些实施方案的微生物群落中，所述无细胞的第二核酸由质粒或噬菌体组成。在一些实施方案的微生物群落中，所述期望的微生物有机体包含微生物有机体的两种或更多种不同物种，其中所述第一核酸由所述不同物种中的仅一种或多于一种组成。在一些实施方案的微生物群落中，所述微生物群落由微生物组组成。例如，所述微生物组是选自以下的微生物组：胃肠道、皮肤、乳腺、胎盘、生物流体、精液、子宫、阴道、卵泡、肺、唾液、口腔、粘膜、结膜、胆道
和土壤，或者任何所列项目中的两种或更多种的组合。在一些实施方案的微生物群落中，所述微生物群落在对象体内原位。一些实施方案的微生物群落是对象自体的，以及是所述对象离体的(例如，用于对象的组织或器官的微生物组的聚居或再聚居。在一些实施方案的微生物群落中，所述微生物群落是工业培养物。附图的简要说明
8.图1是显示根据本公开内容的一些实施方案在微生物群落中生产分泌的抗微生物肽的方法的流程图。
9.图2是显示根据本公开内容的一些实施方案的微生物群落的示意图，所述微生物群落包括通过编码抗微生物肽的核酸和与编码抗微生物肽的核酸具有相同序列的无细胞核酸进行遗传修饰的期望的微生物有机体。
10.图3是显示根据本公开内容的一些实施方案在微生物群落中生产分泌的抗微生物肽的方法的示意性流程图。详述
11.本文提供了用于在微生物群落中生产分泌的抗微生物肽的方法(其在本文中也可称为“生产方法”)。一般而言，生产方法可以包括将编码抗微生物肽的核酸施用至微生物群落中存在的一种或多种微生物有机体，从而遗传修饰所述微生物有机体。遗传修饰的微生物有机体可以将抗微生物肽分泌到微生物群落的环境中，例如以防御不期望的微生物有机体，如污染物和/或病原体。抗微生物肽可以以足以减慢或抑制微生物有机体生长或杀死微生物有机体的水平分泌，所述微生物有机体对抗微生物肽敏感。另一方面，遗传修饰的微生物有机体可以对抗微生物肽具有抗性，并且可以在分泌的抗微生物肽存在下在微生物群落中继续生长和繁殖。许多微生物群落，如微生物组或工业发酵，或在食品或药物或化妆品制造环境中，含有特定比例或化学计量的不同类型的微生物有机体。有利地，本文所述的方法和微生物群落可以通过对微生物有机体进行原位遗传修饰来维持微生物有机体的现有比例或化学计量。此外，微生物群落通常含有适于该微生物群落及其环境的期望的微生物有机体的特定菌株。可以容易地鉴定这些期望的菌株，因此可以被靶向表达编码抗微生物肽的核酸。然而，不期望的微生物有机体可能更难以鉴定，并且它们存在于微生物群落中的时间和位置可能是未知的。因此，通过原位修饰已知的微生物有机体，如本文所述的生产方法和微生物群落可以通过原位提供期望的微生物有机体来有效地和可靠地抑制微生物群落中不期望的微生物有机体的生长和繁殖。同时，可以保留适合微生物群落和环境的期望的微生物有机体的特定菌株，微生物群落内微生物有机体的化学计量也可以保留。
12.一些实施方案的生产方法允许一种或多种期望的微生物有机体优先于不期望的微生物有机体生长，所述不期望的微生物有机体对微生物群落中的抗微生物肽敏感。微生物群落可以包括期望的微生物有机体，其被遗传修饰以产生由核酸编码的抗微生物肽，利用所述核酸，微生物有机体被遗传修饰(不必向微生物群落中加入外源遗传修饰的微生物有机体)。
13.根据本公开内容的实施方案，可以通过将编码抗微生物肽的核酸原位施用至微生物群落来遗传修饰微生物群落中期望的微生物有机体(例如，如本文所述遗传修饰的微生物有机体)。例如，可以通过质粒、噬菌体、染色体外阵列、附加体或微型染色体施用核酸。
14.如本文所用，“微生物群落”具有本领域普通技术人员鉴于本公开内容所理解的其
普通和常规的含义。它是指在环境中包含微生物有机体的两种或更多种不同物种的异质群体。例如，微生物群落可以由微生物组或工业或化妆品或药物制造培养物组成。微生物群落可以包含不同分类学分类的微生物有机体，如不同属和/或种、和/或相同物种的不同菌株。例如，微生物群落可以包含至少106、107、108、109、10
10
、10
11
或10
12
种微生物有机体，包括任何两个所列值之间的范围。
15.本文还提供了微生物群落，其包含期望的微生物有机体，所述微生物有机体经遗传工程化以表达编码抗微生物肽和所述抗微生物肽框内的分泌信号的核酸，其中编码所述抗微生物肽的核酸也存在于所述微生物群落中。参考图2，本公开内容的一些非限制性实施方案包括微生物群落200，其可以含有期望的微生物有机体201，其中的一种或多种可以用核酸220进行遗传修饰210。核酸可以编码抗微生物肽230，其不靶向期望的微生物有机体。核酸还可以编码抗微生物肽框内的分泌信号240，使得肽在表达时包含分泌信号。核酸也可以自由地存在(例如，在微生物群落内的任何细胞或微生物区室210之外)。当通过本公开内容的方法修饰微生物群落时，施用以遗传修饰期望的微生物有机体的核酸中的至少一些可能不会被递送至期望的微生物有机体，而是可能在微生物群落中保持无细胞状态。
16.在本公开内容中可以使用任何合适的微生物群落。合适的微生物群落包括但不限于微生物组或工业培养物。可以使用任何合适的微生物组。合适的微生物组的实例包括但不限于在胃肠道、皮肤、乳腺、胎盘、生物流体、精液、子宫、阴道、卵泡、肺、唾液、口腔、粘膜、结膜、胆道和土壤中发现的那些。微生物有机体
17.如本文所用，“微生物有机体”、“微生物”和这些词根术语的变型(如复数等)具有本领域技术人员鉴于本公开内容所理解的其常规和普通的含义。它们涵盖任何天然存在的物种或者完全合成的原核或真核单细胞有机体，以及古生物物种(archae species)。因此，该术语可指细菌物种、真菌物种和藻类的细胞。“微生物有机体”和“微生物”在本文中可以互换使用，这些词根术语的相应变型也可以互换使用。
18.可以根据本文的实施方案使用的合适微生物包括但不限于细菌、酵母和藻类，例如光合微藻。此外，可以合成完全合成的微生物基因组并将其移植到单个微生物细胞中，以产生能够连续自我复制的合成微生物(参见gibson等人(2010),“creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome,”science 329:52-56,，在此通过引用以其整体并入)。因此，在一些实施方案中，微生物是完全合成的。遗传元件(包括调节基因表达的元件和编码基因产物的元件(例如细菌素、免疫调节剂、毒物、解毒剂和工业上有用的分子)的期望组合可以在期望底盘(chassis)上组装成部分或完全合成的微生物。用于工业应用的基因工程化的微生物有机体的描述也可见于wright等人,(2013)“building-in biosafety for synthetic biology”,microbiology 159:1221-1235。
19.根据本文的实施方案，可以使用多种细菌物种和菌株，并且可以提供基于已知物种的“底盘”的遗传修饰的变体或合成细菌。可以根据本文的实施方案使用的具有工业上可应用特性的示例性细菌包括但不限于芽孢杆菌属物种(例如凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis))，类芽孢杆菌属物种，链霉菌属物种，微球菌属物种，棒杆菌属物种，醋杆
菌属物种，蓝细菌属物种，沙门氏菌属物种，红球菌属物种，假单胞菌属物种，乳杆菌属物种，肠球菌属物种，双歧杆菌属物种，拟杆菌属物种，产碱杆菌属物种，克雷伯氏菌属物种，类芽孢杆菌属物种，节杆菌属物种，棒杆菌属物种，短杆菌属物种，水生栖热菌(thermus aquaticus)，施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)，嗜热梭菌(clostridium thermocellus)和大肠杆菌(escherichia coli)。
20.根据本文的实施方案，可以使用多种酵母物种和菌株，并且可以提供基于已知物种的“底盘”的遗传修饰的变体或合成酵母。可以根据本文的实施方案使用的具有工业上可应用特性的示例性酵母包括但不限于酵母属物种(例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(saccharomyces bayanus)、布拉氏酵母菌(saccharomyces boulardii))，假丝酵母属物种(例如产朊假丝酵母(candida utilis)、克鲁斯假丝酵母(candida krusei))，裂殖酵母属物种(例如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、日本裂殖酵母(schizosaccharomyces japonicas))，毕赤酵母属或汉逊酵母属物种(例如，巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)或多形汉逊酵母(hansenula polymorpha))和酒香酵母属物种(例如，克劳森酒香酵母(brettanomyces claussenii))。
21.根据本文的实施方案，可以使用多种藻类物种和菌株，并且可以产生基于已知物种的“底盘”的遗传修饰的变体或合成藻类。在一些实施方案中，藻类包含光合微藻类。可用于生物燃料并且可以根据本文的实施方案使用的示例性藻类物种包括布朗葡萄藻(botryococcus braunii)、小球藻属物种、特氏杜氏藻(dunaliella tertiolecta)、江蓠属物种、颗石类微藻(pleurochrysis carterae)和马尾藻属物种。另外，许多藻类物种可用于食物产品、肥料产品、废物中和、环境修复和碳水化合物制造(例如，生物燃料)。
22.出于任何合适的目的，期望的微生物有机体可有益于微生物群落。在某些实施方案中，期望的微生物有机体对例如微生物群落本身的生长和/或维持、微生物群落所属的较大环境、使用微生物群落的目的等提供益处。在某些实施方案中，本公开内容的微生物群落被不期望的微生物有机体污染。由于任何相关的原因，不期望的微生物有机体可能是不期望的。在一些实施方案中，不期望的微生物是病原体。例如，不期望的微生物有机体可能对微生物群落(例如，包含微生物组的宿主)的宿主有机体(例如，哺乳动物)是致病的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体可能对在微生物群落中或在微生物群落周围生长的有机体是致病的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体是与微生物群落中期望的微生物有机体的生长竞争和/或干扰微生物群落中期望的微生物有机体的生长的微生物有机体。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体选自病原体、污染物以及与微生物群落中期望的微生物有机体的生长竞争和/或干扰微生物群落期望的微生物有机体的生长的微生物有机体。核酸
23.根据本文所述的一些实施方案的生产方法和微生物群落，抗微生物肽(例如细菌素)由核酸(如dna、rna或这些的组合)编码。例如，抗微生物肽(例如细菌素)基因的dna序列可编码翻译成蛋白质的mrna转录物，所述蛋白质包含抗微生物肽(如细菌素)，基本上由其组成或由其组成。考虑了核酸可以包含一个或多个非天然存在的核苷酸，例如锁核酸(lna)、肽核酸(pna)等。在本文的一些实施方案的方法和组合物中，可以将编码多肽原的多核苷酸递送到微生物中，并且可以稳定地整合到这些微生物的染色体中，或者可以游离于
基因组存在，例如在质粒、染色体外阵列、附加体、微型染色体等中。
24.用于微生物细胞的遗传修饰的示例性载体包括但不限于质粒、染色体外阵列、附加体、微型染色体、病毒(包括噬菌体)和转座元件。另外，应理解，包含期望序列的完整微生物基因组可以在细胞中合成和组装(参见，例如gibson等人(2010),science 329:52-56)。因此，在一些实施方案中，合成具有期望特征的微生物基因组(或其部分)，如细菌素多核苷酸，并将其引入到微生物细胞中。
25.在一些实施方案中，提供了用于将一种或多种期望的细菌素和/或免疫调节剂多核苷酸插入到多核苷酸序列(例如将编码包含细菌素的多肽原的盒插入到表达载体中)的盒。示例性的盒包括但不限于cre/lox盒或flp/frt盒。在一些实施方案中，所述盒定位在质粒上，使得具有编码期望多肽原的期望多核苷酸的质粒可以容易地引入到微生物细胞中。在一些实施方案中，所述盒定位在微生物细胞的基因组中的期望位置。
26.在一些实施方案中，质粒缀合可用于将期望的质粒从“供体”微生物细胞引入受体微生物细胞中。-moreno等人,(2013)multicellular computing using conjugation for wiring.plos one 8(6):e65986，将其在此通过引用以其整体并入。例如，一些实施方案的遗传修饰的期望的微生物有机体可以将编码抗微生物肽的质粒引入到微生物群落中的另一种微生物有机体中。在一些实施方案中，质粒缀合可以通过将缀合质粒从供体微生物细胞引入到受体微生物细胞来遗传修饰受体微生物细胞。不受任何特定理论的限制，包含相同或功能上相同的复制基因组的缀合质粒通常不能共存于相同的微生物细胞中。因此，在一些实施方案中，质粒缀合通过引入新的缀合质粒以取代受体细胞中存在的另一种缀合质粒来“重编程”受体微生物细胞。在一些实施方案中，质粒缀合用于工程化(或重新工程化)具有编码多肽原的特定核酸或编码不同多肽原的不同核酸的组合的微生物细胞。根据一些实施方案，提供了包含不同核酸的多种缀合质粒，所述核酸包含多种不同的多肽原。质粒可以包含本文所述的额外遗传元件，例如启动子、翻译起始位点等。在一些实施方案中，在供体细胞的集合中提供了多种缀合质粒，从而可以选择包含期望质粒的供体细胞用于质粒缀合。在一些实施方案中，选择细菌素的特定组合和/或比例，并将适合的供体细胞(编码特定的多肽原)与目的微生物细胞缀合，以将包含该组合的缀合质粒引入到受体细胞中。分泌信号
27.为了促进抗微生物肽的分泌，抗微生物肽还可以包含合适的分泌信号。已经显示跨分类群的分泌系统共有核心特征，包括完整的膜易位设备，其通常是异源三聚体蛋白复合物，如细菌中的secyeg复合物或真核生物中的sec61复合物或这些复合物成员的古菌同源物，如古菌中的secy/sec61α和sece/sec61γ同源物(参见，例如，等人,cell 91:563-566(1997))，将其通过引用以其整体并入本文。
28.已经描述了可应用于革兰氏阳性、革兰氏阴性或两种类型细菌的几种典型的细菌分泌系统，并在例如green等人,microbiol spectr.4:doi:10.1128/microbiolspec.vmbf-0012-2015(2016)中进行了综述，将其在此通过引用以其整体并入本文。以下重现的green等人的表1突出了细菌sec、tat、t1ss、t2ss、t3ss、t4ss、t5ss、t6ss、seca2、分拣酶、注射体和t7ss分泌系统的特征。对于真核微生物有机体，也可以使用合适的分泌系统。例如，已经详细地表征了酿酒酵母中的分泌途径(参见，例如，novick等人,cell 25:461-469(1981)，
将其通过引用以其整体并入本文)。表1：细菌分泌系统的类别
29.易位到细胞外环境可以由信号序列启动。信号序列在生命领域中是典型保守的，并且例如，n-末端信号序列可以包含带正电的n末端、疏水性氨基酸残基的核心和极性更大的c末端(等人,cell 91:563-566(1997))。可选地，对于c-末端信号序列，这些特征可以是相反的顺序。各种信息学工具可用于鉴定预测的原核和真核信号序列，例如，如armenteros等人,nature biotechnology,37,420-423(2019)(将其通过引用以其整体并入)中所述的signalp 5.0。在万维网上以www.cbs.dtu.dk/services/signalp获取signalp的当前版本。
30.应理解，根据本文的实施方案，期望的微生物有机体是已知的，因此，可以选择合适的分泌信号(与相关的分泌系统相容)。抗微生物肽
31.如本文所用，“抗微生物肽”(包括这些词根术语的变型，如“抗微生物肽”)具有本领域普通技术人员鉴于本公开内容所理解的其常规和普通的含义。它是指一类杀死微生物有机体或阻止微生物有机体生长的肽。尽管抗微生物肽通常被称为一类靶向微生物有机体的无脊椎动物和脊椎动物基因产物，但细菌素通常被称为一类靶向微生物有机体的微生物基因产物。然而，为了简洁起见，本文所用的“抗微生物肽”广泛地涵盖经典的抗微生肽(例如，其赋予对抗微生物有机体的先天免疫活性)以及细菌素。因此，合适的抗微生物肽包括源自任何来源(例如，来源于原核生物或真核生物，如哺乳动物、真菌、植物等，或者部分或完全合成的)的多肽，其减少或抑制微生物有机体的生长或者杀死微生物有机体。在一些实施方案中，抗微生物肽包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：无脊椎动物和脊椎动物的先天免疫系统的肽。因此，在一些实施方案中，抗微生物肽包括一类靶向微生物有机体的
无脊椎动物和脊椎动物基因产物。
32.合适的抗微生物肽的实例可以见于例如可在万维网上以aps.unmc.edu/ap/访问的抗微生物肽数据库(the antimicrobial peptide database)，将其通过引用以其整体并入本文。已经鉴定并编目了超过1000种抗微生物肽及其变体。抗微生物肽数据库描述在wang等人(2016),nucleic acids res.44(database issue):d1087-d1093中，将其通过引用以其整体并入本文。适用于本文的实施方案(如在生产方法和/或微生物群落中)的抗微生物肽的实例包括细菌素、抗细菌肽、抗病毒肽、抗hiv肽、抗真菌肽、抗寄生虫肽和抗癌肽，如dermaseptins(例如，dermaseptin-b2)、abaecin、ct-amp1、andropin、apidaecin、天蚕素(cecropin)、角质毒素(ceratotoxin)、dermacidin、maximin h5、家蚕抗菌肽(moricin)、蜂毒肽(melittin)、爪蟾抗菌肽(magainin)、铃蟾抗菌肽(bombinin)、brevinin、esculentin、蟾蜍抗菌肽(buforin)、cap18、ll37、protegrin、prophenin、indolicidin、鲎素肽(tachyplesins)、防御素(defensin)、果蝇霉素(drosomycin)、aurein 1.1、乳铁蛋白肽b(lactoferricin b)和海利霉素(heliomicin)或者任何所列项目中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，抗微生物肽包含细菌素，dermaseptins(例如，dermaseptin-b2)、abaecin、ct-amp1、andropin、apidaecin、天蚕素、角质毒素、dermacidin、maximin h5、家蚕抗菌肽、蜂毒肽、爪蟾抗菌肽、铃蟾抗菌肽、brevinin、esculentin、蟾蜍抗菌肽、cap18、ll37、protegrin、prophenin、indolicidin、鲎素肽、防御素、果蝇霉素、aurein1.1、乳铁蛋白肽b和海利霉素或者任何所列项目中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，本公开内容的抗微生物肽包括天然存在的抗微生物肽或者其突变体或变体，或者编码它们的核酸。在一些实施方案中，本公开内容的抗微生物肽包括非天然存在的抗微生物肽(如部分或完全合成的抗微生物肽或变体抗微生物肽)或编码其的核酸。在一些实施方案中，本公开内容的抗微生物肽是非天然存在的肽序列或编码其的核酸。在一些实施方案中，抗微生物肽与参考抗微生物肽(例如dermaseptin-b2、abaecin、ct-amp1、andropin、aurein 1.1、乳铁蛋白肽b或海利霉素，或seq id no:4-450(偶数)和699-737(奇数)中的任一个)具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，包括任何两个所列值之间的范围，例如70％-99％、75％-99％、80％-99％、85％-99％、90％-99％、95％-99％、97％-99％、70％-95％、75％-95％、80％-95％、85％-95％、90％-95％、70％-90％、75％-90％、80％-90％和85％-90％。这种抗微生物肽可以被称为“变体”抗微生物肽。可以使用blast软件(默认参数)来确定同一性百分比(altschul,s.f.等人,(1990)“basic local alignment search tool.”j.mol.biol.215:403-410，在万维网上以blast.ncbi.nlm.nih.gov访问)。
33.在一些实施方案中，本公开内容的抗微生物肽包含细菌素,基本上由其组成或由其组成。如本文所用，“细菌素”和该词根术语的变型具有本领域技术人员鉴于本公开内容所理解的其常规和普通的含义。它是指这样的多肽，所述多肽由宿主细胞分泌并能够中和不同于制备多肽的单独宿主细胞的至少一种细胞，包括与宿主细胞克隆相关的细胞和其它微生物细胞。表达特定“免疫调节剂”(本文更详细论述的)的细胞对特定细菌素或细菌素组的中和作用是免疫的。因此，细菌素可以中和产生细菌素的细胞和/或其它微生物细胞，只要这些细胞不产生适当的免疫调节剂。因此，宿主细胞可以通过分泌细菌素对多种其它微
生物有机体发挥细胞毒性或生长抑制作用。示例性的细菌素示于seq id no:4-450(偶数)和699-737(奇数)中。编码这些细菌素的示例性核酸提供为seq id no:5-451(奇数)和700-738(偶数)。细菌素的详细描述，包括使用细菌素以控制微生物细胞生长的方法和组合物，可以见于例如美国专利号9,333,227，将其在此通过引用以其全文并入。“细菌素”不受多肽来源的限制，并且例如考虑了涵盖任何细菌素，如天然存在的细菌素、合成的细菌素及其变体和组合。本文详细描述了合适的细菌素的实例。
34.尽管许多细菌素是天然存在的(例如，seq id no:4-450(偶数)和699-737(奇数)中所示的天然存在的细菌素)，但本领域技术人员将理解，在本文所述的方法、系统和试剂盒的一些实施方案中，细菌素包含除seq id no:4-450(偶数)和699-737(奇数)的细菌素和编码seq id no:4-450(偶数)和699-737(奇数)的核苷酸序列之外的天然存在的细菌素、或者非天然存在的细菌素或者合成细菌素(如工程化的细菌素)或者其变体(其也可以是一些实施方案的一种工程化的细菌素)。在一些实施方案中，相对于野生型细菌素，工程化的细菌素在相同或不同微生物或微生物物种上具有增强或降低水平的细胞毒性或生长抑制活性。在一些实施方案中，抗微生物肽(或细菌素)不包含羊毛硫细菌素。
35.几种基序已被认为是细菌素的特征。例如，基序ygxgv(seq id no:2)是iia类细菌素的n-末端共有序列特征，其中x是任意氨基酸残基。因此，在一些实施方案中，候选(或变体)细菌素(例如工程化的细菌素)包含与seq id no:2具有至少约50％同一性的n-末端序列或其变体。在一些实施方案中，候选(或变体)细菌素(例如工程化的细菌素)包含含有seq id no:2的n-末端序列。另外，一些iib类细菌素包含gxxxg基序。不受任何特定理论的限制，认为gxxxg基序可以介导细胞膜中螺旋蛋白之间的缔合，例如以通过细胞膜相互作用促进细菌素介导的中和。因此，在一些实施方案中，细菌素(例如工程化的细菌素)包含促进与细胞膜相互作用的基序。在一些实施方案中，细菌素包含gxxxg基序。任选地，包含gxxxg基序的细菌素可以包含螺旋结构。除了本文所述的结构之外，本文所用的“细菌素”还涵盖对微生物细胞具有与本文明确提供的任何细菌素基本相同作用的结构。
36.已经鉴定和表征了许多细菌素。不受理论的限制，可以将示例性的细菌素分类为通常经历翻译后修饰的“i类”细菌素和通常未修饰的“ii类”细菌素。关于分类细菌素的额外信息可以见于cotter,p.d.等人，“bacteriocins-a viable alternative to antibiotics”nature reviews microbiology(2013)11:95-105，将其通过引用以其整体并入本文。
37.根据本文中的实施方案，可以使用许多细菌素。示例性的细菌素示于seq id no:4-450(偶数)和699-737(奇数)。编码这些细菌素的示例性核酸提供为seq id no:5-451(奇数)和700-738(偶数)。细菌素和一些编码细菌素的多核苷酸序列的详细描述(包括使用细菌素控制微生物细胞生长的方法和组合物)可以见于例如美国专利号9,333,227，将其通过引用以其整体并入本文。在美国专利号9,333,227的表1.2中教导了合适的细菌素的一些实例，将其通过引用以其整体并入本文。“细菌素”不受多肽来源的限制，并且例如预期了涵盖任何细菌素，如天然存在的细菌素、合成的细菌素及其变体和组合。本文详细描述了合适的细菌素的实例。
38.一些抗微生物肽(如细菌素)具有细胞毒性活性(例如“杀菌剂”作用)，因此可以杀死微生物有机体，例如细菌、酵母、藻类、合成微生物等。一些抗微生物肽(如细菌素)可以例
如通过阻止细胞周期而抑制微生物有机体(例如细菌、酵母、藻类、合成微生物等)的繁殖(例如“抑菌”作用)。不受理论的限制，细菌素可以以多种方式实现靶标微生物细胞的中和。例如，细菌素可渗透细胞壁，从而使细胞壁去极化并干扰呼吸。
[0039]“抗生素”和该词根术语的变型具有本领域技术人员鉴于本公开内容所理解的其常规和普通的含义。它是指可以杀死至少一种微生物细胞或阻止至少一种微生物细胞生长的代谢途径的代谢物或中间体。一些抗生素可以由微生物细胞(例如细菌)产生。一些抗生素可以化学合成。应理解，细菌素不同于抗生素，至少在于细菌素是指基因产物(在一些实施方案中，其经历额外的翻译后加工)或其合成类似物，而抗生素是指代谢途径的中间体或产物或其合成类似物。
[0040]
在一些实施方案中，抗微生物肽(如细菌素)包含经历翻译后修饰(例如切割)或者添加一个或多个官能团的多肽。
[0041]
在一些实施方案中，包含两种或更多种抗微生物肽(如细菌素)或其部分的融合多肽比所述两种或更多种抗微生物肽或其部分的任一种单独的抗微生物肽具有针对更广范围的微生物有机体的中和活性。例如，已经显示杂合抗微生物肽显示出针对致病革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗微生物活性(等人,(2012),febs open bio,2:12-19)。应注意，ent35-mccv融合细菌素从n-末端到c-末端包含n-末端甘氨酸、肠道菌素crl35、包含三个甘氨酸的接头和c末端小菌素v。
[0042]
本文考虑了抗微生物肽(如细菌素)可包含两种或更多种多肽的融合物，例如具有抗微生物(如细菌素)活性的两种或更多种多肽。在一些实施方案中，抗微生物肽或候选抗微生物肽包含嵌合蛋白。在一些实施方案中，变体抗微生物肽(如细菌素)或工程化的抗微生物肽(如工程化的细菌素)包含融合多肽，所述融合多肽包含两种或更多种抗微生物肽(如细菌素)。在一些实施方案中，变体抗微生物肽(如细菌素)或工程化的抗微生物肽(如细菌素)包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含两种或更多种抗微生物肽(如细菌素)或其片段。在一些实施方案中，融合物的两种或更多种抗微生物肽包含seq id no:4-450(偶数)和699-737(奇数)的多肽，和/或由seq id no:5-451(奇数)和700-738(偶数)的核酸编码的多肽，或其变体或修饰。在一些实施方案中，融合多肽具有比单独的抗微生物肽更广谱的活性，例如具有针对更多微生物有机体的中和活性、在更宽范围的环境条件下的中和活性和/或更高效率的中和活性。在一些实施方案中，融合多肽包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种抗微生物肽。在一些实施方案中，两种或更多种抗微生物肽多肽经由共价键(例如肽键)彼此融合。在一些实施方案中，接头定位在融合多肽的两个单独的抗微生物多肽之间。在一些实施方案中，接头包含一个或多个甘氨酸，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个甘氨酸。在一些实施方案中，在细胞内切割接头以产生包含在融合蛋白中的单独的抗微生物肽(如细菌素)。在一些实施方案中，本文提供的变体抗微生物肽(如变体细菌素)或工程化的抗微生物肽(如工程化的细菌素)包含修饰以提供相对于未修饰的或候选的抗微生物肽(例如细菌素)的期望活性谱。例如，变体抗微生物肽(例如细菌素)或工程化的抗微生物肽(例如细菌素)可以针对与未修饰的或候选的抗微生物肽(例如细菌素)相同的有机体具有增强的或降低的活性。可选地，修饰的抗微生物肽(例如细菌素)可以针对有机体具有增强的活性，针对所述有机体，未修饰的或候选的抗微生物肽(例如细菌素)具有较低的活性或无活性。
[0043]
在一些实施方案中，基于期望的抗微生物调节的类型和所靶向的微生物有机体的特定分类类别、物种或菌株，选择抗微生物肽的特定中和活性或活性范围(例如，细胞毒性或阻止微生物繁殖)。因此，在一些实施方案中，选择特定的抗微生物肽或抗微生物肽的组合。例如，在一些实施方案中，基于被调节的不期望的微生物有机体，将期望的微生物有机体工程化以表达特定的抗微生物肽。在一些实施方案中，例如，如果要杀死污染的不期望的微生物有机体，则提供至少一种细胞毒性抗微生物肽(如细胞毒性细菌素)。在一些实施方案中，选择有效对抗通常在特定培养物、微生物组、特定地理位置或者生长在特定地理位置或工业培养物中的特定类型的培养物中出现的污染物的细菌素或细菌素的组合。在一些实施方案中，例如需要调节微生物细胞比例的实施方案，提供了抑制微生物繁殖的抗微生物肽。不受理论的限制，许多细菌素可对微生物有机体具有中和活性，所述微生物有机体通常占据与产生细菌素的物种相同的生态位。因此，在一些实施方案中，当需要抗微生物肽活性的特定谱时，细菌素选自占据与细菌素所靶向的一种或多种微生物有机体相同(或相似)生态位的宿主物种。在一些实施方案中，选择抗微生物肽的特定组合和/或比例以靶向单一微生物有机体(其可以包括靶向一种或多于一种该类型的微生物有机体，例如克隆相关的微生物有机体)。例如，与单一抗微生物肽相比，可通过抗微生物肽的预定混合物和/或比例更有效地靶向特定类型的微生物有机体。
[0044]
例如，在一些实施方案中，抗微生物肽需要抗真菌活性(如抗酵母活性)。已经鉴定了许多具有抗真菌活性的细菌素。例如，来自芽孢杆菌的细菌素已经显示出对酵母菌株具有中和活性(参见adetunji和olaoye(2013)malaysian journal of microbiology 9:130-13，将其在此通过引用以其整体并入)，粪肠球菌(enterococcus faecalis)肽(wlppagllgrcgrwfrpwllwlq sgaqy kwlgnlfglgpk,seq id no:1)已经显示出对念珠菌属物种具有中和活性(参见shekh和roy(2012)bmc microbiology 12:132，将其在此通过引用以其整体并入)，以及来自假单胞菌的细菌素已经显示出对真菌如新月弯孢菌(curvularia lunata)、镰刀菌属物种、长蠕孢属物种和蠕孢菌属(biopolaris)物种具有中和活性(shalani和srivastava(2008)the internet journal of microbiology.volume 5number 2.doi:10.5580/27dd——在万维网上以archive.ispub.com/journal/the-internet-journal-of-microbiology/volume-5-number-2/screening-for-antifungal-activity-of-pseudomonas-fluorescens-against-phytopathogenic-fungi.html#sthash.d0ys03uo.1dkut1us.dpuf访问，将其在此通过引用以其整体并入)。例如，来自枯草芽孢杆菌的杀葡孢菌素(botrycidin)aj1316(参见zuber,p等人,(1993)peptide antibiotics.in bacillus subtilis and other gram-positive bacteria:biochemistry,physiology,and molecular genetics ed.sonenshein等人,pp.897-916,american society for microbiology，将其在此通过引用以其整体并入)和alirin b1(参见shenin等人,(1995)antibiot khimioter 50:3-7，将其在此通过引用以其整体并入)已经显示出具有抗真菌活性。因此，在一些实施方案(例如其中需要中和真菌微生物有机体的实施方案)中，细菌素包含杀葡孢菌素aj1316或alirin b1中的至少一种。
[0045]
例如，在一些实施方案中，在特定环境(例如特定微生物群落的培养物)中的抗微生物肽活性是期望的，并且以预定的混合物和/或比例选择抗微生物肽以便杀死不同于期望的微生物有机体的不期望的微生物有机体或阻止不同于期望的微生物有机体的不期望
的微生物有机体的生长。可以选择通常由期望的微生物产生的细菌素，因为期望的微生物有机体可以已经产生针对这些细菌素的相关免疫调节剂，或者可以容易地被工程化以产生免疫调节剂。因此，所选择的细菌素可靶向不期望的微生物细胞(包括尚未存在于微生物群中的不期望的微生物细胞)，同时几乎不引起或不引起期望的微生物有机体的中和。例如，在一些实施方案中，选择特定比例的抗微生物肽以便中和通常在蓝细菌培养环境中发现的入侵微生物有机体，同时保留蓝细菌。已经在多种蓝细菌物种中鉴定了保守性细菌素多肽的簇。例如，在至少43种蓝细菌物种中已经鉴定出至少145个推定的细菌素基因簇，如wang等人,(2011),genome mining demonstrates the widespread occurrence of gene clusters encoding bacteriocins in cyanobacteria.plos one 6(7):e22384中所报告的，将其在此通过引用以其整体并入。示例性的蓝细菌细菌素显示在seq id no.:420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448和450中。
[0046]
在一些实施方案中，选择一种或多种抗微生物肽活性，并提供包含期望化学计量的抗微生物肽的多肽原。一些实施方案的抗微生物肽可以最初在多肽原中产生，所述多肽原包含一个或多个抗微生物肽序列，并且其可以被切割以产生单独的抗微生物肽。多肽原可以包含拷贝数目的单独抗微生物肽，使得在切割时抗微生物肽以特定的化学计量存在。因此，两种或更多种不同抗微生物肽的混合物可以以期望的比例或化学计量产生。制备期望的比例和期望的化学计量的抗微生物肽的方法描述在例如pct公开号wo2019/046577中，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，多肽原由微生物细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生。多肽原可以经历切割(例如通过切割酶如天然存在的或合成的蛋白酶进行加工)以产生抗微生物肽本身的多肽。因此，在一些实施方案中，抗微生物肽由前体多肽产生。编码多肽原的多核苷酸可以例如使用核酸合成和/或分子克隆来制备，并且可以用于产生多肽原。
[0047]
在一些实施方案中，抗微生物肽(及其比例)可以基于其中和一种或多种入侵有机体的能力来选择，所述入侵有机体可能试图在特定的培养物中生长。在一些实施方案中，抗微生物肽(及其比例)可以基于其限制特定有用微生物菌株在环境中，例如在工业原料中，或在发酵罐中，或在食品、药物或化妆品制造环境中，或在组织环境如肠或皮肤微生物组中生长的能力，或在维持或调节植物、植物根和/或土壤中的微生物群，或保持或维持物、药物或化妆品产品的质量的能力来选择。在一些实施方案中，基于现有环境中的一种或多种微生物菌株或微生物菌株群来选择一种或多种抗微生物肽活性(和/或比例)。例如，在一些实施方案中，如果在环境中鉴定出特定类别的入侵者或可能的入侵者，并且可以选择中和抗微生物肽的混合物(及其比例)来中和所鉴定的入侵者。在一些实施方案中，选择抗微生物肽以中和环境中所有或基本上所有的微生物细胞，例如以消除培养环境中的工业培养物，使得可以将新的工业培养物引入培养环境中，或者防止或抑制药物或化妆品制造环境的污染，或者防止或最小化食品、药物或化妆品的污染或腐败。免疫调节剂
[0048]
在一些实施方案中，特定的免疫调节剂或免疫调节剂的特定组合赋予对特定抗微生物肽(例如细菌素等)、特定种类或类别的抗微生物肽或抗微生物肽的特定组合的免疫。示例性抗微生物肽(例如细菌素等)鉴定在美国专利第9,333,227号的表2中，免疫调节剂可赋予对所述示例性抗微生物肽的免疫。示例性的免疫调节剂序列包括，例如seq id no:
452-540(偶数)和seq id no:453-541(奇数)中的任一个。
[0049]
虽然美国专利第9,333,227号的表2和本技术的序列表鉴定了示例性免疫调节剂的“来源有机体”，但根据本文的一些实施方案，这些免疫调节剂可以容易地在其它天然存在的、遗传修饰的或合成的微生物中表达，以提供期望的抗微生物肽免疫活性。因此，如本文所用，“免疫调节剂”具有本领域技术人员鉴于本公开内容所理解的其常规和普通的含义，并且不仅是指本文明确提供的结构，而且是指与本文所述的“免疫调节剂”结构具有基本上相同作用的结构，包括完全合成的免疫调节剂和提供对在功能上等同于本文公开的抗微生物肽的抗微生物肽(例如细菌素等)的免疫的免疫调节剂。
[0050]
编码seq id no:452-540(偶数)的多肽的示例性多核苷酸序列显示在seq id no:453-541(奇数)中。本领域技术人员将容易理解遗传密码是简并的，而且，密码子使用可以根据表达基因产物的特定有机体而变化，因此，特定的多肽可以由一种以上的多核苷酸编码。在一些实施方案中，基于表达抗微生物肽免疫调节剂的有机体的密码子使用来选择编码抗微生物肽免疫调节剂的多核苷酸。在一些实施方案中，基于表达抗微生物肽免疫调节剂的特定有机体，对编码抗微生物肽免疫调节剂的多核苷酸进行密码子优化。
[0051]
大范围的功能性免疫调节剂可以包含本文公开的免疫调节剂的特征，从而提供对seq id no:452-540(偶数)的免疫调节剂的大程度的同一性。在一些实施方案中，免疫调节剂与美国专利第9,333,227号的表2中的任一种多肽具有至少约50％的同一性，例如至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性或者由前述值中的任两个定义的同一性范围。启动子
[0052]
启动子是本领域熟知的。启动子可用于驱动一个或多个基因的转录。在一些实施方案中，启动子驱动如本文所述的编码抗微生物肽或蛋白酶的多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子驱动编码如本文所述的包含两种或更多种抗微生物肽的多肽原的多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子驱动免疫调节剂多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子驱动如本文所述的编码抗微生物肽的多核苷酸的表达，但微生物细胞不表达针对这些抗微生物肽中的一种或多种的免疫调节剂(例如，细胞可缺乏驱动免疫调节剂转录的启动子，或可缺乏编码免疫调节剂的核酸)。在一些实施方案中，启动子在微生物细胞中驱动编码包含两种或更多种抗微生物肽的多肽原的多核苷酸的表达，但微生物细胞不表达针对这些抗微生物肽中的一种或多种的免疫调节剂(例如，细胞可缺乏驱动免疫调节剂转录的启动子，或可缺乏编码免疫调节剂的核酸)。一些启动子可以始终驱动转录(“组成型启动子”)。一些启动子可以仅在选择的环境下驱动转录(“条件性启动子”)，例如取决于环境条件、化合物、基因产物、细胞周期的阶段等的存在与否。
[0053]
本领域技术人员将理解，根据期望的表达活性，可以选择适当的启动子，并将其与待表达的核酸序列顺式放置。在本文的seq id no:544-698中提供了具有示例性活性并且在本文的一些实施方案中有用的示例性启动子。本领域技术人员将理解，一些启动子与特定的转录机制(例如rna聚合酶、一般转录因子等)相容。因此，尽管对于本文所述的一些启
动子鉴定了相容的“物种”，但考虑了在一些实施方案中，这些启动子可以容易地在除了所鉴定的物种之外的微生物中发挥功能，例如在具有相容的内源性转录机制的物种，包含相容的转录机制的遗传修饰的物种，或包含相容的转录机制的完全合成的微生物有机体中。
[0054]
本文中seq id no:544-698的启动子可以从biobricks基金会公开获得。注意，biobricks基金会鼓励根据biobrick
tm
公共协议(bpa)使用这些启动子。seq id no:544-698的启动子仅以非限制性实例的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到，根据本文的一些实施方案，可以容易地使用上述启动子的许多变体和许多其它启动子(包括从天然存在的有机体分离的启动子、其变体和完全合成的启动子)。
[0055]
应理解，本文所述的任何“编码”多核苷酸(例如抗微生物肽多核苷酸、免疫多核苷酸或者编码包含两种或更多种抗微生物肽的多肽原的核苷酸)通常在期望启动子的控制下表达。在一些实施方案中，单一“编码”多核苷酸在单一启动子的控制下。在一些实施方案中，两个或更多个“编码”多核苷酸在单一启动子的控制下，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多核苷酸。
[0056]
通常，特定转录物的翻译起始由转录物的编码序列的5’端或5’处的特定序列调节。例如，编码序列可以从被配置为与起始trna配对的起始密码子开始。尽管天然存在的翻译系统通常使用met(aug)作为起始密码子，但容易理解，可以将起始trna工程化以结合任何期望的三联体，因此，在某些实施方案中，除aug以外的三联体也可作为起始密码子发挥功能。另外，起始密码子附近的序列可促进核糖体组装，例如kozak序列((gcc)gccrccaugg，seq id no:542，其中r代表“a”或“g”)或典型真核翻译系统中的内部核糖体进入位点(ires)或典型原核翻译系统中的shine-delgarno序列(ggaggu，seq id no:543)。因此，在一些实施方案中，包含“编码”多核苷酸序列的转录物，例如抗微生物肽多核苷酸或免疫多核苷酸，或编码包含两种或更多种抗微生物肽的多肽原的核苷酸，包含适当的起始密码子和翻译起始序列。在一些实施方案中，例如，如果两个或更多个“编码”多核苷酸序列以顺式定位在转录物上，则每个多核苷酸序列包含适当的起始密码子和翻译起始序列。在一些实施方案中，例如，如果两个或更多个“编码”多核苷酸序列以顺式定位在转录物上，则这两个序列在单一翻译起始序列的控制之下，并且任一个提供单一多肽，所述多肽能够与顺式编码的两个多肽一起发挥功能。在微生物群落中原位生产分泌的抗微生物肽的方法
[0057]
在一些实施方案中，描述了在微生物群落中原位生产分泌的抗微生物肽的方法(为了简明起见，在本文中也称为“生产方法”)。所述方法可以包括向微生物群落的至少一种期望的微生物有机体原位施用核酸，其中核酸编码抗微生物肽，所述抗微生物肽不杀死期望的微生物有机体或不阻止期望的微生物有机体的繁殖。因此，可以将期望的微生物有机体配置成表达抗微生物肽。所述方法可以包括允许遗传修饰的期望的微生物有机体在群落中生长，使得其分泌抗微生物肽。
[0058]
参考图1，显示了根据一些非限制性实施方案在微生物群落中原位生产分泌的抗微生物肽的方法(“生产方法”)100的流程图。生产方法可以包括将期望的微生物有机体鉴定为微生物群落的成员110(例如微生物组或工业培养物中的微生物群落)。生产方法可以包括将核酸原位施用至微生物群落的至少一种期望的微生物有机体，其中核酸编码不杀死所鉴定的期望的微生物有机体或不阻止所鉴定的期望的微生物有机体的繁殖的抗微生物
肽。因此，至少一种期望的微生物有机体被遗传修饰以表达抗微生物肽120。例如，经遗传修饰的期望的微生物有机体可以包含在本文所述启动子控制下的编码抗微生物肽的核酸。转到框130，生产方法可以包括允许遗传修饰的期望的微生物有机体在微生物群落中生长，其中遗传修饰的期望的微生物有机体分泌抗微生物肽。抗微生物肽可以杀死微生物群落中的任何微生物有机体或阻止微生物群落中的任何微生物有机体的生长，所述微生物有机体对所述抗微生物肽敏感。期望的微生物有机体，包括遗传修饰的期望的微生物有机体，可以抵抗抗微生物肽的抗微生物作用。例如，如果抗微生物肽包含细菌素，则遗传修饰的期望的微生物有机体可以产生细菌素的免疫调节剂。例如，微生物群落可以在对象的微生物组中，并且核酸可以在体内递送。例如，微生物群落可以在对象的微生物组的样品中，并且核酸可以离体递送，并且可以将包含遗传修饰的期望的微生物有机体的微生物组施用至对象以定殖(或再定殖)对象的组织或器官，例如以代替失调的微生物组。考虑了本文所述的生产方法可以将微生物群落(如微生物组)中的任何微生物有机体转化为具有抵抗不期望的微生物有机体的抗微生物特性的益生菌。
[0059]
可以使用多种合适的技术来施用编码如本文所述的抗微生物肽的核酸。编码抗微生物肽的核酸也可以称为“抗微生物肽核酸”。在一些实施方案的生产方法和组合物中，微生物被遗传修饰以包含编码并能够表达一种或多种如本文所述的抗微生物肽的核酸序列。
[0060]
在本文的一些实施方案的生产方法和组合物中，可以将编码一种或多种抗微生物肽的多核苷酸递送至微生物，并且所述多核苷酸可以被稳定地整合到这些微生物的染色体中，或者可以游离于基因组存在，例如在质粒、染色体外阵列、附加体、微型染色体等中。用于分子克隆和将核酸引入微生物有机体中的技术描述在例如green和sambrook,“molecular cloning:a laboratory manual,”第4版,cold spring harbor laboratory press,2012中。
[0061]
在一些实施方案中，生产方法包括将期望的微生物有机体鉴定为微生物群落的成员。例如，可以对微生物群落或其培养物的样品进行核酸测序，如16s测序，以鉴定微生物群落中的微生物有机体。例如，可以基于微生物群落的期望特性，例如目的化合物的发酵或代谢来选择期望的微生物有机体。生产方法还可以包括将核酸原位施用至微生物群落的至少一种期望的微生物有机体。核酸可以编码不杀死所鉴定的期望的微生物有机体或不阻止所鉴定的期望的微生物有机体的繁殖的抗微生物肽。抗微生物肽可以如本文所述。因此，对期望的微生物有机体(或多种有机体)进行遗传修饰以表达抗微生物肽。例如，编码抗微生物有机体的核酸可以与期望的微生物有机体中的启动子可操作地连接。所述方法还可以包括允许遗传修饰的期望的微生物有机体在微生物群落中生长，使得遗传修饰的期望的微生物有机体分泌抗微生物肽。在一些实施方案的生产方法中，如果存在对抗微生物肽缺乏免疫力的不期望的微生物有机体，则抗微生物肽可杀死不期望的微生物有机体或阻止不期望的微生物有机体的生长。
[0062]
注意，，在没有向微生物群落中加入任何额外的微生物有机体的情况下，通过将编码抗微生物肽的核酸原位加入到微生物群落中期望的微生物有机体中，微生物群落可以包含遗传修饰的微生物有机体。另外，适于微生物群落和/或群落所处环境的菌株的期望的微生物有机体可保留在微生物群落中。因此，在一些实施方案的生产方法中，从施用所述核酸到允许遗传修饰的期望的微生物有机体生长，所述期望的微生物有机体彼此之间的比例基
本上保持不变。在一些实施方案中，从施用所述核酸到允许遗传修饰的期望的微生物有机体生长，期望的微生物有机体彼此之间的比例改变小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％、小于1％或更小，或由前述值中的任两个限定的范围内的百分比(例如，1-5％、1-30％、1-15％、5-30％、5-15％、10-30％、10-15％、15-30％)。在一些实施方案中，从施用核酸之前和之后(例如，在允许遗传修饰的期望的微生物有机体生长之前)，期望的微生物有机体彼此之间的比例基本上保持不变。在一些实施方案中，从施用核酸之前和之后(例如，在允许遗传修饰的期望的微生物有机体生长之前)，期望的微生物有机体彼此之间的比例改变小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％、小于1％或更小，或由前述值中的任两个限定的范围内的百分比(例如，1-5％、1-30％、1-15％、5-30％、5-15％、10-30％、10-15％、15-30％)。在一些实施方案中，所述方法不包括向微生物群落中加入任何微生物有机体。
[0063]
在不受理论限制的情况下，考虑了产生靶向不期望的微生物有机体的抗微生物肽足以赋予微生物群落益处。因此，在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，在不施用编码相应免疫调节剂的核酸的情况下施用编码抗微生物肽的核酸。例如，期望的微生物有机体可以已经包含抗微生物肽的免疫调节剂(如果抗微生物肽包含细菌素)，或者期望的微生物可以是对抗微生物肽不敏感的分类群或菌株。可以凭经验(例如通过直接培养)或通过鉴定对抗微生物肽的非敏感性是已知特征的微生物有机体的分类学分类、物种或菌株来确定期望的微生物有机体的非敏感性。在一些实施方案的生产方法的中，没有将编码抗微生物肽的免疫调节剂的核酸施用至所述至少一种期望的微生物有机体。
[0064]
还考虑了尽管期望的微生物有机体可能是已知的或容易鉴定的，但不期望的微生物有机体可具有未知的和/或未鉴定的特征。例如，不期望的微生物有机体的身份可能是未知的，或者微生物群落中存在不期望的微生物有机体的时间和/或位置可能是未知的。因此，在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，在所述分泌之前，微生物群落被一种或多种未知身份的不期望的微生物有机体污染。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的身份是已知的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体是微生物群落的常见污染物或病原体。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的抗微生物肽敏感性是已知的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的抗微生物肽敏感性是未知的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的抗微生物肽敏感性是已知的，并且不期望的微生物有机体的身份是未知的。
[0065]
一些实施方案的生产方法和微生物群落的抗微生物肽可以杀死一种或多种不期望的微生物有机体或者阻止一种或多种不期望的微生物有机体的繁殖。例如，不期望的微生物有机体可能缺乏抗微生物肽的免疫调节剂(如果微生物肽包含细菌素)，或者通过抗微生物肽的带电残基或水解酶活性可能破坏不期望的微生物有机体的细胞膜或细胞壁，引起孔形成，导致对不期望的微生物有机体的细胞毒性。
[0066]
考虑了在一些实施方案的生产方法和微生物群落中，抗微生物肽可以是经工程化以表达抗微生物肽的期望的微生物有机体外源的。例如，抗微生物肽可以来自与期望的微生物有机体不同的菌株或物种的基因组，或者抗微生物肽可以是天然存在的抗微生物肽的变体，或者抗微生物肽可以是完全合成的。因此，在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，抗微生物肽不被遗传修饰的期望的微生物有机体物种的野生型基因组编码。在一些实
施方案的生产方法或微生物群落中，抗微生物肽是遗传修饰的微生物有机体外源的，或者抗微生物肽是合成的。
[0067]
在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，核酸编码两种或更多种不同的抗微生物肽。例如，核酸可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗微生物肽，包括任何两个所列值之间的范围，例如2-5、2-7、2-10、3-5、3-7、3-10、5-7或5-10种抗微生物肽。例如，单一核酸可以编码两种或更多种抗微生物肽，例如，核酸可以编码本文所述的多肽原。例如，两种或更多种不同的核酸可以一起编码抗微生物肽。例如，在一些实施方案的生产方法中，施用核酸包括施用编码不同抗微生物肽的两种或更多种不同的核酸。在一些实施方案的生产方法中，一起选择不同的抗微生物肽以靶向抗生素抗性感染(例如，多重耐药(mdr)细菌的感染)。
[0068]
在一些实施方案的生产方法中，施用核酸包括施用包含本文所述核酸的质粒、染色体外阵列、附加体、微型染色体，或者施用包含核酸的噬菌体。在一些实施方案的生产方法中，施用核酸包括施用包含本文所述核酸的质粒，或者施用包含核酸的噬菌体。
[0069]
考虑了经遗传修饰以表达一种或多种如本文所述的抗微生物肽的期望的微生物有机体可赋予群落中其它微生物有机体益处，例如通过使它们防御不期望的微生物有机体。因此，如果微生物群落中的一些，但不是所有期望的微生物有机体被遗传修饰以表达抗微生物肽，则微生物群落通常可以获得针对不期望的微生物有机体的保护的益处。在一些实施方案的生产方法中，期望的微生物有机体包含微生物有机体的两种或更多种不同物种，其中将核酸施用至所述不同物种中的仅一种或多于一种。
[0070]
在一些实施方案的生产方法中，所述方法还包括将不同的核酸(其也可称为“第二核酸”)原位施用至微生物群落中不同于基因工程化的微生物有机体的微生物有机体(其也可称为“第二微生物有机体”)。不同的(或“第二”)核酸可以编码与核酸不同的抗微生物肽。例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的核酸(包括任何两个所列值之间的范围，例如，1-5、1-7、1-10、2-5、2-7、2-10、3-7、3-10、5-7或5-10)，各自编码不同的抗微生物肽或抗微生物肽的组合。在一些实施方案的生产方法中，不同的核酸(或“第二核酸”)与核酸(或“第一核酸”)同时施用。在一些实施方案的生产方法中，在与核酸(或“第一核酸”)不同的时间和/或位置施用不同的核酸(或“第二核酸”)。在一些实施方案的生产方法中，在与核酸(或“第一核酸”)不同的时间施用不同的核酸(或“第二核酸”)。
[0071]
考虑了根据本文所述的生产方法或微生物群落中的任一种的微生物群落可以由微生物组组成。例如，微生物组可以包含微生物群落，基本上由其组成，或由其组成。适用于本文所述实施方案的示例性微生物组包括选自以下的微生物组：胃肠道、皮肤、乳腺、胎盘、生物流体、精液、子宫、阴道、卵泡、肺、唾液、口腔、粘膜、结膜、胆道和土壤。还应注意，微生物群落可以在环境内，所述环境可以具有额外的特征，如温度、压力、湿度、ph等。根据本文所述的生产方法或微生物群落中的任一种的期望的微生物菌株可适于微生物组、微生物群落和/或环境。在一些实施方案的生产方法中，微生物群落由微生物组组成。
[0072]
在一些实施方案的方法中，可以将核酸离体施用至期望的微生物有机体。例如，微生物群落可以是对象自体的，并且可以离体施用核酸。所述方法还可以包括将包含遗传修饰的期望的微生物有机体的微生物群落施用至对象。例如，包含微生物群落的样品可以获自对象的微生物组，可以将核酸离体施用至期望的微生物有机体，以及可以将包含遗传修
饰的期望的微生物有机体的微生物群落施用至对象。任选地，在收集样品之后，可以除去或根除(例如，通过抗生素和/或抗微生物肽)内源性微生物组，并且可以将包含遗传修饰的期望的微生物有机体的微生物群落施用至对象以代替被除去或根除的内源性微生物组。在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，微生物群落在对象的微生物组的保存的健康样品中。在施用时，对象可能患有其微生物组的失调。可以例如用抗生素和/或抗微生物肽除去或根除对象中的这种微生物组(患有失调)。然后可以将包含遗传修饰的期望的微生物有机体的微生物群落施用至对象。因此，保存的健康样品的微生物群落可以代替失调微生物组。
[0073]
在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，微生物群落由工业培养物组成。例如，工业培养物可以发酵物质以形成目的产物，或者可以降解废物或有毒物质。例如，工业培养物可以发酵原料，或者工业培养物可以用于制造药物或化妆品产品。
[0074]
参考图3，显示了一些非限制性实施方案的生产方法的示意图。生产方法可以包括鉴定310期望的微生物有机体301，所述微生物有机体301是微生物群落300(例如微生物组或工业培养物中的微生物群落)的成员。所述方法可以包括将编码抗微生物肽304的核酸施用320至至少一种期望的微生物有机体302，并获得遗传修饰的期望的微生物有机体303。遗传修饰的期望的微生物有机体可以被配置成表达抗微生物肽。例如，遗传修饰的期望的微生物有机体可包含在本文所述启动子控制下的编码抗微生物肽的核酸。转到框330，生产方法可以包括遗传修饰的期望的微生物有机体在允许其生长时将抗微生物肽分泌到微生物群落环境中(330)。在一些实施方案中，生产方法不包括将任何微生物有机体加入到微生物群落中。微生物群落
[0075]
根据本文的一些实施方案，描述了微生物群落。微生物群落可以包含期望的微生物有机体。至少一种期望的微生物有机体可以被遗传修饰，包含第一核酸。第一核酸可编码不靶向一种或多种期望的微生物有机体的第一抗微生物肽。第一核酸还可以编码第一抗微生物肽框内的分泌信号。微生物群落还可以包含与第一核酸具有相同序列的无细胞的第二核酸。例如，微生物群落可以是，例如人或非人哺乳动物的微生物组的一部分，或者可以是工业培养物的一部分，例如发酵、或药物或化妆品制造培养物。例如，无细胞的第二核酸的存在可以是表明第一核酸原位施用至期望的微生物有机体(如本文所述)的结构。在一些实施方案的微生物群落中，无细胞的第二核酸由质粒、染色体外阵列、附加体、微型染色体或噬菌体组成。在一些实施方案中，无细胞的第二核酸以足以遗传修饰期望的微生物有机体的量存在于微生物群落中。在一些实施方案中，微生物群落处于足以促进期望的微生物有机体群体的生长或维持的条件下。
[0076]
如本文所述，可有利地对微生物群落(和生产方法)的期望的微生物有机体进行遗传修饰以生产一种或多种不能内源性产生的抗微生物肽。这种遗传修饰可扩大期望的微生物有机体(和微生物群落)对不期望的微生物有机体如病原体或污染物的防御活性范围。因此，在一些实施方案中，第一抗微生物肽不被遗传修饰的期望的微生物有机体物种的野生型基因组编码。
[0077]
考虑了许多抗微生物肽适用于本文所述的微生物群落和生产方法，例如本文所述的细菌素。典型的抗微生物肽的实例也如本文所述。在一些实施方案中，第一抗微生物肽是合成的。在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，第一抗微生物肽是遗传修饰的微生
物有机体外源的。
[0078]
如本文所论述的，期望的微生物有机体可以通过表达抗微生物肽而赋予其自身和/或微生物群落益处，即使它不包含抗微生物肽的免疫调节剂亦如此。因此，在一些实施方案的生产方法或微生物群落中，包含编码抗微生物肽的核酸的期望的微生物有机体不包含编码抗微生物肽的免疫调节剂的核酸。
[0079]
在一些实施方案的微生物群落(或生产方法)中，微生物群落被一种或多种未知身份的不期望的微生物有机体污染。例如，不期望的微生物有机体可包含病原体，或可污染微生物群落，或可干扰微生物群落对工业产品的发酵或生产。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的身份是已知的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体是微生物群落的常见病原体或污染物。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的抗微生物肽敏感性是已知的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的抗微生物肽敏感性是未知的。在一些实施方案中，不期望的微生物有机体的抗微生物肽敏感性是已知的，并且不期望的微生物有机体的身份是未知的。
[0080]
本文的一些实施方案的生产方法和微生物群落的期望的微生物肽可以被遗传修饰以编码和表达两种或更多种不同的抗微生物肽。两种或更多种不同的抗微生物肽可以包含具有选定的抗微生物活性谱的抗微生物肽的混合物。不同的抗微生物肽可以由相同的核酸或不同的核酸编码。在一些实施方案的微生物群落(或生产方法)中，第一核酸编码两种或更多种不同的抗微生物肽，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的抗微生物肽，包括任何两个所列值之间的范围，例如2-5、2-7、2-10、3-5、3-7、3-10、5-7或5-10种抗微生物肽。在一些实施方案的微生物群落(或生产方法)中，遗传修饰的期望的微生物有机体还包含第三核酸，其编码不靶向一种或多种期望的微生物有机体的第二抗微生物肽和第二抗微生物肽框内的分泌信号。
[0081]
在一些实施方案的微生物群落(或生产方法)中，微生物群落可以含有两种或更多种不同的期望的微生物有机体，其各自被遗传修饰以编码和表达一种或多种如本文所述的抗微生物肽。在一些实施方案的微生物群落(或生产方法)中，期望的微生物有机体包含微生物有机体的两种或更多种不同物种。例如，微生物有机体的两种或更多种不同物种可以各自包含编码相同抗微生物肽或不同抗微生物肽的核酸，因此可以各自表达抗微生物肽或不同的抗微生物肽。在一些实施方案的微生物群落(或生产方法)中，期望的微生物有机体包含微生物有机体的两种或更多种不同物种。第一核酸可仅由不同物种中的一种组成。在一些实施方案的微生物群落(或生产方法)中，期望的微生物有机体包含微生物有机体的两种或更多种不同物种。第一核酸可以由两种或更多种不同的物种组成。
[0082]
根据一些实施方案，如本文所述的微生物群落由微生物组组成。例如，微生物组可以是选自以下的微生物组：胃肠道、皮肤、乳腺、胎盘、生物流体、精液、子宫、阴道、卵泡、肺、唾液、口腔、粘膜、结膜、胆道和土壤，包括所列值中的两个或更多个的组合。例如，微生物群落可以在对象体内原位(例如对象的微生物组的一部分)。可以将编码抗微生物肽的核酸体内施用至期望的微生物细胞。例如，编码抗微生物肽的核酸可以被配制用于体内递送至微生物组，如局部、口服或直肠施用。制剂技术的实例描述在remington:the science and practice of pharmacy(allen,l.v.编辑,第22版,pharmaceutical press,philadelphia,pa(2014))中，将其通过引用以其整体并入本文。
[0083]
例如，微生物群落可以是对象自体的，并且可以是对象离体的。例如，如果对象的微生物组是共生的，并且离体的自体微生物组包含健康微生物组的化学计量的微生物物种和/或菌株，则这种微生物群落可用于重新引入或重新定殖对象的微生物组。
[0084]
本文所用的“对象”可以是具有微生物群落的任何合适的对象，其中期望原位生产分泌的抗微生物肽。对象可以是哺乳动物、非人类哺乳动物或非哺乳动物对象。在一些实施方案中，对象是但不限于人类、非人类灵长类、鼠、牛、猪、马、猫、犬或禽类对象。在一些实施方案中，对象是驯养动物。
[0085]
根据一些实施方案，如本文所述的微生物群落是工业培养物。例如，工业培养物可以用于发酵、废物的破坏或者制造药物或化妆品产品。
实施例
实施例1：在微生物组中的微生物群落中原位生产分泌的抗微生物肽
[0086]
获得对象的肠道微生物组的样品，并通过16s测序进行分析以证实在对象的肠道微生物组中存在期望的微生物有机体。双歧杆菌属物种被确定为对象肠道微生物组中期望的微生物有机体。确定双歧杆菌属物种不被杀死并且其生长不被细菌素31抑制。制备用于双歧杆菌属物种的噬菌体以含有编码细菌素31的核酸。通过摄入将噬菌体施用至双歧杆菌属物种，并且通过噬菌体转导对对象肠道中的双歧杆菌属物种群体的一部分进行遗传修饰以表达细菌素31。肠道微生物组中遗传修饰的双歧杆菌属物种将细菌素31分泌到对象的肠道环境中。没有额外的双歧杆菌被加入到对象的肠道微生物组中，使得双歧杆菌物种与对象的肠道微生物组中的其它成员的比例没有改变。实施例2：在工业发酵罐中的微生物群落中原位生产分泌的抗微生物肽
[0087]
使酿酒酵母菌株在工业发酵罐中生长。已知这种酿酒酵母菌株对leucococin c和diversin v41不敏感。将编码leucococin c和diversin v41的质粒施用至发酵罐中的酿酒酵母细胞(例如通过转接合(transconjugation))。用质粒转化发酵罐中酿酒酵母的亚群，并将leucococin c和diversin v41分泌到发酵储液(fermentation stock)中。因此，对发酵罐中的酿酒酵母进行工程化以分泌抗微生物肽。
[0088]
在本文所述的至少一些实施方案中，在实施方案中使用的一个或多个元件可以在另一个实施方案中互换使用，除非这样的替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对本文所述的方法和结构作出各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求限定的主题范围内。
[0089]
关于本文中使用的实质上任何复数和/或单数术语，根据适合于上下文和/或应用，本领域技术人员可从复数转化成单数和/或从单数转化成复数。为了清楚起见，不同单数/复数变换可以在本文清楚地列出。
[0090]
本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语，尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中，通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应被理解为“包括但不限于”，术语“具有”应被理解为“至少具有”，术语“包括(includes)”应被理解为“包括但不限于”等)。本领域的技术人员还将理解，如果打算采用特定数量的引入权利要求叙述，则在权利要求中明确地叙述这种意图，在没有这种叙述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含使用介绍性短语“至少一个(种)”和“一个或多个/一种或多种”来引入权利要求叙述。然而，这种短语的使用不应被解释为暗示通过不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”的权利要求叙述的引入将含有这种引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制为仅包含一个这种陈述的实施方案，即使当同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个/一种或多种”或“至少一个(种)”和不定冠词如“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”时(例如“一个/一种(a)”和/或“一个/一种(an)”应被解释为意指至少一个(种)”或“一个或多个/一种或多种”)亦如此；对于用于引入权利要求叙述的定冠词的使用也是如此。另外，即使明确地叙述了具体数量的引入的权利要求叙述，本领域技术人员将认识到，这种叙述应被解释为意指至少所述的数量(例如，没有其它修饰语的“两个叙述”的基本叙述意指至少两个叙述或者两个或更多个叙述)。此外，在其中使用类似于“a、b和c中的至少一个等”的惯例的那些情况下，通常，这种结构旨在意为本领域技术人员将理解该惯例(例如，“具有a、b和c中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起等的系统)。在其中使用类似于“a、b或c中的至少一个等”的惯例的那些情况下，通常，这种结构旨在意为本领域技术人员将理解该惯例(例如，“具有a、b或c中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起等的系统)。本领域的技术人员还将理解，无论在说明书、权利要求书或附图中，呈现两个或更多个替代术语的几乎任何分离的词语(disjunctive word)和/或短语都应被理解为考虑包括这些术语中的一个、这些术语中的任一个或这两个术语的可能性。例如，短语“a或b”将被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
[0091]
另外，在本公开内容的特征或方面按照马库什组(markush group)描述的情况下，本领域技术人员将认识到本公开内容也按照马库什组中的任何单个成员或成员亚组来描述。
[0092]
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为充分地描述并且使得相同的范围能够被分成至少两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分成下三分之一，中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所叙述的数字，并且是指随后可被分成如本文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个制品的组是指具有1个、2个或3个制品的组。类似地，具有1-5个制品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个制品的组等。
[0093]
虽然本文已经公开了各个方面和实施方案，但其它方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方案是为了说明的目的，而非旨在限制，其中真正的范围和精神由所附权利要求来指示。对于本文所述的每种方法，明确地预期了用于所述方法的相关组合物，也明确地预期了所述方法中的组合物的用途，以及如果适用，制备用于所述方法的药物的方法。例如，对于在包含抗微生物肽或编码抗微生物肽的核酸的微生物群落中原位生产分泌的抗微生物肽的方法，也考虑了用于相应方法中的抗微生物肽(和/或编码抗微生物肽的核酸)，以及根据所述方法抗微生物肽(和/或编码抗微生物肽的核酸)在微生物群落中表达和/或抑制未描述的微生物有机体的用途。还考虑了制备用
于在微生物群落中表达和/或抑制未描述的微生物有机体的包含抗微生物肽(和/或编码抗微生物肽的核酸)的药物的方法。