一种高产青稞的高效选育方法

1.本发明涉及农作物选育技术领域，具体涉及一种高产青稞的高效选育方法。


背景技术：

2.青稞因其内外颖壳分离，籽粒裸露，又称裸大麦，主要分布在我国的高海拔地区，因其在地域种植的不可取代性使其成为当地优势特色农作物。青稞是一种极具营养和食疗价值的谷物，具有“三高两低”(蛋白质含量高、纤维素高、维生素高、脂肪低、糖低)的特点，还富含β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、酚类物质、植物甾醇等多种有效成分及多种有益人体健康的矿物质元素。青稞不仅是藏区农牧民的主要粮食，也是当地主要的酿酒原料和牲畜的优质饲料，其产量的高低直接影响当地农牧民的生活水平。此外，随着青稞加工业不断增加，青稞的消费需求增长迅速，故青稞生产对于经济发展具有十分重要的意义，因此需要选育高产的青稞新品种来满足生产需要。
3.小孢子培养技术是近年来发展起来的一项高效的单倍体育种手段，该技术已在油菜、烟草等作物中实现。与花药培养相比，小孢子培养由于去除了药壁组织，解除了小孢子个体之间的营养和空间竞争，因而培养效率更高，但技术也更为复杂，由于没有了花药壁的保护，完全暴露在提取液中的小孢子活力受到严重影响，小孢子活力的下降又影响到愈伤组织的形成。同时，目前青稞育种为常规杂交育种，育种手段落后耗时较长，一般需要10～14年时间，在一定程度上限制了青稞的选育。迄今为止，采用小孢子育种手段选育青稞品种尚未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种高产青稞的高效选育方法，该选育方法得到的青稞的产量高，育种时间短。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种高产青稞的高效选育方法，包括以下步骤：
7.甘青4号为母本，康青7号为父本，杂交收获f0代；f0代自交获得f1代；f1代自交获得f2代；从f2代植株的孕穗期取穗，分离出小孢子，进行小孢子培育后收获单株，获得高产青稞的稳定株系。
8.优选地，从f2代植株的孕穗期取穗，包括如下步骤：待f2代植株生长至孕穗期，取旗叶距为2～10cm的穗。
9.优选地，所述高产青稞的稳定株系为株高80cm～90cm、穗长≥6cm、穗粒数50≥粒、分蘖率≥2.5个、千粒重≥40g、株型紧凑、熟期转色好、整齐度一致、植株抗倒性强、抗病性强的株系。
10.优选地，所述选育方法还包括将综合性状好、比对照品种增产5％以上的品种进行品系鉴定试验。
11.优选地，所述生长温度为12～18℃。
12.优选地，所述的小孢子培育，包括以下步骤：
13.将花药在预处理培养基中黑暗条件培养，分离得到小孢子；
14.将小孢子用诱导培养基诱导培养，得到愈伤组织；
15.将愈伤组织在再生培养基中培养，得到嫩苗；
16.将嫩苗在生根培养基培养，得到生根植株。
17.优选地，所述预处理培养基为50～70g/l甘露醇、1.0～1.2g/l cacl2、0.9～1.0g/l mes、15～25mg/l秋水仙碱，ph 5.6～6.0；所述黑暗条件培养的温度为20～25℃，时间为3～4天。
18.优选地，所述诱导培养基以n6为基本培养基，添加85～95g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l kt、0.8～1.2mg/l 2,4-d、0.9～1.0g/l mes、1550～1650mg/l谷氨酰胺及380～420mg/l水解干酪素，ph 5.6～6.0；所述诱导培养为在20～25℃下黑暗培养12～14天。
19.优选地，所述再生培养基以2/3ms为基本培养基，添加25～35g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l 6-ba、1.2～1.8mg/l kt及0.04～0.06mg/l naa，用5.0～6.0g/l琼脂粉固化，ph 5.6～6.0；所述在再生培养基中培养为在20～25℃下，光照14～18h、黑暗6～10h培养10～18天。
20.优选地，所述生根培养基以1/2ms为基本培养基，添加25～35g/l蔗糖、3.5～4.5mg/l多效唑及0.04～0.06mg/l naa，用5.0～6.0g/l琼脂粉固化，ph 5.6～6.0；生根培养基培养为在20～25℃下，光照14～18h、黑暗6～10h生根培养14～30天。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
22.本发明提供了一种高产青稞的高效选育方法，通过以甘青4号为母本，康青7号为父本，得到稳定的高产青稞新品种。该青稞产量高，较对照增产7％以上。本发明采用小孢子培育技术，成功获得了稳定的高产青稞新品种，与传统的育种时间(5～6年)相比，本发明获得稳定的高产青稞新品种只需2～3年，极大缩短了育种时间。
附图说明
23.图1为分离出的小孢子的诱导培养图；
24.图2为诱导培养后的小孢子愈伤组织图；
25.图3为再生培养后的嫩苗图；
26.图4为嫩苗在生根培养后的生根植株图；
27.图5为生根植株水培图。
具体实施方式
28.本发明提供了一种高产青稞的高效选育方法，包括以下步骤：
29.甘青4号为母本，康青7号为父本，杂交收获f0代；f0代自交获得f1代；f1代自交获得f2代；从f2代植株的孕穗期取穗，分离出小孢子，进行小孢子培育后收获单株，获得高产青稞的稳定株系。
30.本发明优选母本、父本时，对优质高产青稞种质资源筛选。对国内外优质高产青稞种质资源农艺性状及经济性状进行田间鉴定，包括生育期、株高、穗长、穗粒数、成穗数、千粒重、株型、熟期转色、整齐度、植株抗倒性、抗病性等，最终筛选出优质高产青稞康青7号和
甘青4号。
31.本发明中，甘青4号为母本，康青7号为父本，人工杂交组配，母本去雄时，每个植株只做1个穗去雄，做6个穗以上，获得足够的杂交种子，籽粒成熟时统一混合收获，风干保存，收获杂交种子即为f0代。
32.本发明中，收获f0代后，将f0代种子种植到田间即为f1代，成熟时收获f1代种子，风干保存。
33.本发明中，将f1代种子种植到田间即为f2代。进一步优选，f2代组合前后各种标准品种2行，所述标准品种为结合前后的父母本，通过组合前后种植标准品种防止掺假种。
34.本发明中，从f2代植株的孕穗期取穗，分离出小孢子，进行小孢子培育后收获单株，获得高产青稞的稳定株系。所述f2代植株选取健壮无病植株。所述高产青稞的稳定株系优选为株高80cm～90cm、穗长≥6cm、穗粒数50≥粒、分蘖率≥2.5个、千粒重≥40g、株型紧凑、熟期转色好、整齐度一致、植株抗倒性强、抗病性强的株系。
35.本发明中，从f2代植株的孕穗期取穗。作为优选地，将f2代植株在白天15～18℃、夜晚12～15℃下生长至孕穗期，取旗叶距为2～10cm的穗。本发明中的旗叶距为旗叶与倒二叶之间的距离。所述穗为浅绿色。作为一种可实施方式，用解剖刀轻轻地切下穗，从穗顶切下芒，将70％酒精喷到穗子上，将穗放在工作台70％酒精湿纸巾上，让酒精挥发。本发明通过取旗叶距为2～10cm的穗提高了小孢子取材的准确性和效率，分离的小孢子数量多，同时保证了小孢子的活力。
36.本发明中，从f2代植株的孕穗期取穗，分离出小孢子，再进行小孢子培养。作为一种可实施方式，取穗后用酒精蒸发30分钟后，开始取雄，用两个细镊子在显微镜下从每个小花中取出三个花药，然后将花药放在培养皿中的预处理培养基上，用石蜡封口膜密封培养皿，在培养皿上贴上标签，预处理结束后将花药研磨，低速离心，提取小孢子。所述低速离心可选择100～200g离心8～12min。
37.本发明中，进行小孢子培育后收获单株。所述小孢子培育优选地包括以下步骤：
38.将花药在预处理培养基中在20～25℃黑暗条件培养3～4天，分离得到小孢子；
39.将预处理后的小孢子用诱导培养基在20～25℃暗室诱导培养12～14天，得到愈伤组织；
40.将愈伤组织在再生培养基中，在20～25℃下，光照14～18h、黑暗6～10h荧光白炽灯的光强度为200μe/m2s、70～80％相对湿度的生长室培养10～18天，得到嫩苗；
41.将嫩苗在生根培养基中，在20～25℃下，光照14～18h、黑暗6～10h生根14～30天培养，得到生根植株。
42.本发明，所述预处理培养基优选为50～70g/l甘露醇、1.0～1.2g/l cacl2、0.9～1.0g/l mes、15～25mg/l秋水仙碱，ph 5.6～5.8；进一步优选为55～65g/l甘露醇、1.05～1.15g/l cacl2、0.95～0.98g/l mes、18～23mg/l秋水仙碱，ph 5.7～5.9；更优选为60g/l甘露醇、1.1g/l cacl2、0.976g/l mes、20mg/l秋水仙碱，ph 5.8。本发明通过在上述预处理培养基培养，显著提高了小孢子活力，更易形成愈伤组织。
43.本发明中，所述诱导培养基优选地以n6为基本培养基，添加85～95g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l kt、0.8～1.2mg/l 2,4-d、0.9～1.0g/l mes、1550～1650mg/l谷氨酰胺及380～420mg/l水解干酪素，ph 5.6～6.0；进一步优选为以n6为基本培养基，添加86～93g/l麦芽
糖、0.45～0.55mg/l kt、0.9～1.1mg/l 2,4-d、0.95～0.98g/l mes、1560～1640mg/l谷氨酰胺及390～410mg/l水解干酪素，ph 5.7～5.9；更优选为以n6为基本培养基，添加90g/l麦芽糖、0.5mg/l kt、1.0mg/l 2,4-d、0.976g/l mes、1600mg/l谷氨酰胺及400mg/l水解干酪素，ph 5.8。本发明通过在上述诱导培养基中培养，提高了愈伤组织的产量。
44.本发明中，所述再生培养基优选地以2/3ms为基本培养基，添加25～35g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l 6-ba、1.2～1.8mg/l kt及0.04～0.06mg/l naa，用5.0～6.0g/l琼脂粉固化，ph 5.6～6.0；进一步优选地，以2/3ms为基本培养基，添加27～33g/l麦芽糖、0.45～0.55mg/l 6-ba、1.4～1.6mg/l kt及0.045～0.055mg/l naa，用5.2～5.8g/l琼脂粉固化，ph 5.7～5.9；更优选为以2/3ms为基本培养基，添加30g/l麦芽糖、0.5mg/l 6-ba、1.5mg/l kt及0.05mg/l naa，用5.5g/l琼脂粉固化，ph 5.8。本发明通过在上述再生培养基培养后，显著提高了成苗率。
45.本发明中，所述生根培养基优选地以1/2ms为基本培养基，添加25～35g/l蔗糖、3.5～4.5mg/l多效唑及0.04～0.06mg/l naa，用5.0～6.0g/l琼脂粉固化，ph 5.6～6.0；进一步优选地，以1/2ms为基本培养基，添加27～33g/l蔗糖、3.8～4.3mg/l多效唑及0.045～0.055mg/l naa，用5.3～5.8g/l琼脂粉固化，ph 5.7～5.9；更优选为以1/2ms为基本培养基，添加30g/l蔗糖、4.0mg/l多效唑及0.05mg/l naa，用5.5g/l琼脂粉固化，ph 5.8。本发明通过在上述生根培养基中培养，促进植株的生根，提高了植株的成活率。
46.本发明中，作为一种可实施方式，预处理培养基和诱导培养基可用0.22μm膜过滤灭菌，再生培养基和生根培养基通过0.11mpa、121℃高温高压灭菌15min。
47.本发明得到生根植株，用细水雾移栽到土壤中保持水分或水培2周，移栽在直径30cm的花盆中，在16/8h光/暗的光照条件下，在24
±
4℃的温度下在温室中进行种子生产，收获双单倍体种子。
48.本发明中，所述的选育方法还包括选择综合性状好、比对照增产幅5％以上的品系进行品系比较试验。
49.作为一种可实施方式，所述品系比较试验采用随机区组排列，种植3次，小区长5.0m，宽2.5m，10行区、行距0.25m、区距0.25m、，面积12.5m2，播种量按25万粒/亩计算，每行播种560粒，于3月18日手锄开沟撒播。选择综合性状好、性状稳定、品系比较试验比对照品种增产5％以上的品系，参加区域试验。作为一种可实施方式，所述对照品种为甘青4号。
50.作为一种可实施方式，所述区域试验采用随机区组排列，种植3次，小区长5.0m，宽2.5m，10行区、行距0.25m、区距0.25m、，面积12.5m2，播种量按25万粒/亩计算，每行播种560粒，按照当地播期开沟撒播。
51.作为一种可实施方式，生产试验采用随机排列，无重复，小区面积333m2播种量按每亩30万粒计算，以当地主栽品种为统一对照，田间管理同当地大田。
52.本发明以甘青4号为母本，康青7号为父本，杂交得到的青稞新品种产量高，同时采用上述小孢子培育成功获得了稳定的高产青稞新品种，该选育方法极大地缩短了育种时间。
53.在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
54.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显
然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
55.实施例1
56.一种高产青稞的高效选育方法，步骤如下：
57.(1)对优质高产青稞种质资源筛选，从国内外优质高产青稞种质资源农艺性状及经济性状包括生育期、株高、穗长、穗粒数、成穗数、千粒重、株型、熟期转色、整齐度、植株抗倒性、抗病性进行田间鉴定，筛选出优质高产青稞康青7号和甘青4号；
58.(2)以甘青4号为母本，以康青7号为父本，人工杂交组配，母本去雄时每个植株只做1个穗，做6个穗以上，获得足够的杂交种子，籽粒成熟时统一混合收获，风干保存，收获杂交种子即为f0代；
59.(3)将f0代种子种植到田间即为f1代，成熟时收获f1代种子，风干保存；
60.(4)将f1代种子种植到田间即为f2代，f2代组合前后各种标准品种2行，f2代大量分离，待孕穗时选取健壮无病植株进行小孢子培育；
61.(5)将f2代供体植株在白天15℃，夜晚12℃下，选择旗叶距为2～10cm的穗，用解剖刀轻轻地切下，从穗顶切下芒，将70％酒精喷到穗子上，将穗放在工作台70％酒精湿纸巾上，让酒精挥发；
62.(6)酒精蒸发30分钟后，开始取花药，用两个细镊子在显微镜下从每个小花中取出三个花药，然后将花药放在培养皿中的预处理培养基上，用石蜡封口膜密封培养皿，在培养皿上贴上标签，置于24℃黑暗条件下培养3～4天，然后将花药研磨，培养液以150g离心10min，提取小孢子；其中预处理培养基为60g/l甘露醇、1.1g/l cacl2、0.976g/l mes、20mg/l秋水仙碱，ph 5.8；
63.(7)将小孢子在诱导培养基中，在24℃的暗室中培养12～14天；其中，诱导培养基为以n6为基本培养基(n6培养基见表1)，添加90g/l麦芽糖、0.5mg/l kt、1.0mg/l 2,4-d、0.976g/l mes、1600mg/l谷氨酰胺及400mg/l水解干酪素，ph 5.8；
64.(8)将愈伤组织在再生培养基中，在24℃下，光照16h、黑暗8h，荧光白炽灯的光强度为200μe/m2s、70～80％相对湿度的生长室培养10～18天，得到嫩苗；其中再生培养基为以2/3ms为基本培养基(ms培养基见表2)，添加30g/l麦芽糖、0.5mg/l 6-ba、1.5mg/l kt及0.05mg/l naa，用5.5g/l琼脂粉固化，ph 5.8；
65.(9)将嫩苗在生根培养基中，在20～25℃下，光照14～18h、黑暗6～10h生根14～30天培养，得到生根植株；其中生根培养基为以1/2ms为基本培养基(ms培养基见表2)，添加30g/l蔗糖、4.0mg/l多效唑及0.05mg/l naa，用5.5g/l琼脂粉固化，ph 5.8。
66.(10)用细水雾移栽到土壤中保持水分或水培2周继续培育，在16h光照/8h黑暗、24℃的条件下生长，收获单株，选择选择农艺形状好、株高80cm～90cm、穗长≥6cm、穗粒数50≥粒、分蘖率≥2.5个、千粒重≥40g、株型紧凑、熟期转色好、整齐度一致、植株抗倒性强、抗病性强的株系，获得高产青稞的稳定株系；
67.(11)选择农艺形状好、株高80cm～90cm、穗长≥6cm、穗粒数50≥粒、分蘖率≥2.5个、千粒重≥40g、株型紧凑、熟期转色好、整齐度一致、植株抗倒性强、抗病性强株系，参与品系鉴定试验；
68.(12)选择综合性状好、比对照增产幅5％以上的品系进行品系比较试验：
69.采用随机区组排列，种植3次，小区长5.0m，宽2.5m，10行区、行距0.25m、区距0.25m、，面积12.5m2，播种量按25万粒/亩计算，每行播种560粒，于3月18日手锄开沟撒播高产青稞新品种和对照品种甘青4号，结果显示，产量较甘青4号增产8.2％。
70.(13)区域试验：采用随机区组排列，种植3次，小区长5.0m，宽2.5m，10行区、行距0.25m、区距0.25m、，面积12.5m2，播种量按25万粒/亩计算，每行播种560粒，按照当地播期开沟撒播高产青稞新品种和对照品种甘青4号，结果显示，产量较对照甘青4号增产7.1％。
71.表1 n6培养基配方
72.[0073][0074]
表2 ms培养基配方
[0075]
[0076][0077]
其中，预处理4天后的花药见图1，诱导培养后的愈伤组织图片见图2，再生培养7天后的嫩苗见图3，移栽到土壤中的植株见图4。
[0078]
由图1～4可知，本发明通过小孢子培育，成功获得了高产青稞品种。
[0079]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。