一株芽孢杆菌在水稻镉污染修复上的应用

1.本发明涉及植物根际促生和污染修复菌技术领域，芽孢杆菌在促生水稻并修复镉污染上的应用。


背景技术：

2.镉是一种生物富集能力很强的金属，当镉通过食物链到人或动植物体内会产生持久的毒性，对人的各种器官及免疫系统造成严重的危害，自20世纪50年代，日本富山县神通川流域居民因食用镉超标大米而导致大规模水俣病发生以来，镉污染问题逐渐引起了全世界的关注(杜丽娜等，2012)。随着工业化和城市化进程的加快，土壤重金属污染状况日益严重。2014年全国土壤调查显示，19.4％的耕地土壤重金属超标。其中镉点位超标率为7.0％。目前土壤重金属修复技术主要分为物理修复、化学修复和生物修复三大类。而修复的机理可以分为两大类：一类是去除，通过重金属富集植物措施将污染土壤中的镉去除；另一类是固定化，即降低重金属在土壤中的有效性，使其难以迁移以及被生物富集(李兴杰，2019)。
3.生物肥具有活化土壤养分、提高肥料利用率、促进生长、提高产量与品质等巨大优势，同时还具有繁殖快、代谢强、修复费用少、无二次污染等独特优势，在修复土壤污染中日显重要。依据全球市场分析报告，2020年土壤污染微生物修复剂，美国市场销售额已突破116亿美元。随着污染攻坚和耕地保育等国家粮食安全的需求，预测我国在2027年将达到110亿美元。譬如芽孢杆菌(bacillus)、链霉菌(streptomyces)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、葡萄球菌属 (staphylococcus)、硫杆菌属(thiobacillus)等在重金属污染修复应用中显示了极大的潜力。
4.大猩猩芽孢杆菌具有促生和耐重金属毒性等功能，且具有产业化生产工艺简单，货架期长，易于在土壤环境中存活定殖等优势，然而，作为一株新型的菌株资源，其在水稻镉污染修复尚未被挖掘与研究。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的是提供一种大猩猩芽孢杆菌的应用，该芽孢杆菌能有效促进水稻生长，能有效修复水稻镉污染，能有效改善糙米品质。
6.为此，本发明提供的技术方案是这样的：
7.一株大猩猩芽孢杆菌在水稻镉污染修复上的应用，所述的大猩猩芽孢杆菌用于提高水稻植株株高。
8.一株大猩猩芽孢杆菌在水稻镉污染修复上的应用，所述的大猩猩芽孢杆菌用于提高水稻单株产量。
9.一株大猩猩芽孢杆菌在水稻镉污染修复上的应用，所述的大猩猩芽孢杆菌用于提高水稻糙米产量。
10.一株大猩猩芽孢杆菌在水稻镉污染修复上的应用，所述的大猩猩芽孢杆菌用于降低水稻糙米镉含量。
11.一株大猩猩芽孢杆菌在水稻镉污染修复上的应用，所述的大猩猩芽孢杆菌用于降低水稻根系镉含量。
12.一株大猩猩芽孢杆菌在水稻镉污染修复上的应用，所述的大猩猩芽孢杆菌用于水稻植株茎叶镉含量。
13.上述的一株大猩猩芽孢杆菌bacillus massiliogorillae在水稻镉污染修复上的应用，所述的大猩猩芽孢杆来源于2020年03月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心gdmcc(广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼),保藏编号gdmcc no:60979的大猩猩芽孢杆菌。
14.与现有技术相比，由于大猩猩芽孢杆菌yc9l高产生长素iaa，并且兼具解磷、解钾、耐重金属，对水稻的生长有显著的促进效果，并显著修复镉污染。具体表现如下：
15.(1)本发明提供的技术方案利用大猩猩芽孢杆菌有高效的产iaa的能力，促进植物体细胞内遗传物质和蛋白质的合成,加快细胞的分裂与分化，对水稻植株有高效的促生能力，能显著提高水稻植株株高，有效增加水稻单株产量和糙米产量。
16.(2)本发明提供的技术方案利用大猩猩芽孢杆菌能修复重金属污染功能，来降低水稻根系镉含量、植株茎叶镉含量和籽粒镉含量。
17.(3)本发明提供的技术方案利用大猩猩芽孢杆菌能提高水稻籽粒品质功能，来提高糙米铁锰锌含量，提高糙米粗蛋白含量。
附图说明
18.图1是yc9l菌促进水稻生长田间试验俯瞰图
19.图2是yc9l菌促进水稻生长田间试验照片
20.图3是yc9l菌促进水稻株高的效果
21.图4是yc9l菌对土壤有效cd含量的影响
22.图5是yc9l菌降低水稻根系cd含量的效果
23.图6是yc9l菌降低水稻植株茎叶cd含量的效果
24.图7是yc9l菌降低水稻糙米重金属cd含量的效果
25.图8是yc9l菌降低水稻糙米重金属pb含量的效果
26.图9是yc9l菌提高水稻糙米fe含量的效果
27.图10是yc9l菌提高水稻糙米cu含量的效果
28.图11是yc9l菌提高水稻糙米mn含量的效果
29.图12是yc9l菌提高水稻糙米zn含量的效果
30.图13是yc9l菌对水稻糙米直链淀粉含量的影响
31.图14是yc9l菌提高水稻糙米粗蛋白含量的效果
32.图15是yc9l菌提高水稻单株产量的效果
33.图16是yc9l菌提高水稻单株糙米含量的效果
34.图17是yc9l菌分泌iaa特性
35.图18是yc9l菌的显微照片
具体实施方式
36.具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
37.以下实施例中除特别说明外，均为本领域中的常规实验方法和操作步骤。
38.本技术所述的大猩猩芽孢杆bacillus massiliogorillae来源于2020年03月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号gdmcc no:60979的大猩猩芽孢杆菌。
39.实施例1，yc9l促进水稻生长效果田间试验
40.菌悬液制备：
①
将菌种活化后接入lb液体培养基，过夜培养后转接至新鲜的lb液体培养基中，摇至od600＝1.0；
②
将菌液于离心机中离心，转速为8000rpm，离心5min；
③
将菌体重悬于等量无菌水中，待水稻移苗时蘸根施用。试验地点：韶关市仁化县银场坪镉污染农田，北纬n：25
°
05
′
44.04
″
、东经e： 113
°
37
′
51.51
″
。试验时间：2021年8月16日移栽。于8月26日测定水稻株高和土壤有效cd含量，于11月25日收获水稻，并采集根茎叶和籽粒样品进行分析(图1和图2)。试验处理：分为2个处理，处理1：施用农户常规肥料；处理2：施加yc9l菌剂，具体操作如下，yc9l菌剂兑水1000倍，然后秧苗蘸根 1秒钟后，直接常规移栽，每个处理3个重复，每个小区面积为12m2。菌剂显著促进水稻生长：对水稻降镉有显著效果。施用菌剂10天，yc9l菌剂显著提高水稻株高，与对照相比，yc9l菌剂处理提高株高8.5％(图3)。
41.菌剂显著降低了水稻镉含量，yc9l菌剂没有改变土壤有效镉含量(图4)， yc9l菌剂显著降低水稻根系cd含量(图5)，收获期菌剂处理和对照根系cd含量分别为11.56mg/kg和5.45mg/kg,菌剂显著降低根系镉含量53％。收获期菌剂处理和对照植株茎叶cd含量分别为1.87和0.94mg/kg，菌剂显著降低植株茎叶镉含量49.7％(图6)。菌剂处理和对照糙米cd含量分别为0.50和0.26mg/kg，菌剂对水稻糙米降镉率为48％(图7)。另外菌剂也显著降低了水稻糙米pb含量，菌剂处理和对照糙米pb含量分别为0.18和0.15mg/kg(图8)。
42.菌剂显著提高了水稻糙米铁铜锰锌等有益元素的含量，与对照相比，分别 26.2％、16.7％、21.3％和16.0％。菌剂显著提高了水稻糙米粗蛋白含量，与对照相比，菌剂处理粗蛋白含量提高了13.9％，但直链淀粉含量下降了12.5％(图9
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图14)。
43.菌剂显著提高了水稻产量，yc9l菌剂处理和对照处理的单株产量分别为 34.7和27.4g/棵，yc9l菌剂处理和对照处理的糙米产量分别为33.6和21.2g/ 棵，由此说明yc9l菌剂显著提高了水稻产量(图15-图16)。
44.综合以上，yc9l菌剂能显著促进水稻植株生长，提高水稻产量，提高了粗蛋白、籽粒锌和铁含量。显著降低水稻镉含量，在水稻镉污染土壤安全利用方面显示了巨大的应用前景
45.实施例2，yc9l菌株的筛选，(1)分离以广州天河绿化带植被根际土壤为筛选土样，称取10g土样加入装有90ml无菌水的250ml三角瓶中(加玻璃珠)，摇床震荡30min。使细菌充分分散，静置20～30s。然后于90℃水浴10min，取上清液进行10倍递增梯度稀释，采用10-3-10-4稀释度，吸取各梯度100μl 涂布于lb固体平板上，37℃下倒置培养24小时。观察并按照菌落形态、大小、颜色等生长特征，分别挑取菌落于lb固体培养基上纯化后，对分离到的菌进行保存备用。(2)筛选采用salkowski比色法测定所分离菌株产iaa的能力。将分离到的菌接种至含有l-色氨酸(100mg/l)的4ml lb液体培养基中，30℃、 180r/mim培养摇床培养
24h，进行定性与定量。取200μl菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入200μl salkowski比色液(500ml 35％hclo4+10ml 0.5mol/lfecl3)。200μl iaa标准液(50mg/l)作为阳性对照，200μl未接菌的含有 l-色氨酸的lb液体培养基做空白对照。室温、避光条件下放置30min后观察，记录颜色变红的菌株(图17a)。对上述菌株的菌悬液进行iaa定量，分光光度法测定菌液的od600值，然后将菌液10000rpm/min离心10min，取上清液加入等体积salkowski比色液，避光静置30min，测定其od530值。根据iaa梯度稀释测定方法绘制标准曲线，计算单位体积发酵液中iaa的含量。筛选出产iaa 量高的菌株，yc9l产iaa能力较高，分泌iaa达46.72mg/l(图17b)。
46.实施例3 yc9l菌属革兰氏阳性菌，挑取yc9l单菌落于液体lb培养基中培养24h，吸取4μl无菌水于载玻片上，吸取1μl菌液于加好的无菌水中，混匀，然后自然干燥。过火焰2-3次进行固定；结晶紫初染1min，水洗，自然晾干；碘液媒染1min，水洗，晾干；95％的乙醇脱色20s，水洗，晾干；番红复染1min，水洗，晾干，在100倍油镜下镜检观察，菌体呈蓝紫色(图18a)，yc9l为革兰氏阳性菌。
47.实施例4 yc9l菌可产芽孢，挑取yc9l单菌落于液体lb培养基中培养24h，吸取4μl无菌水于载玻片上，吸取1μl菌液于加好的无菌水中，混匀，然后自然干燥。过火焰2-3次进行固定。滴加孔雀绿染液已固定的涂片上，用镊子夹住载玻片在酒精灯火焰上加热，使染液在30s内冒蒸汽3-4次；水洗，晾干；用番红水溶液复染1min，水洗，晾干。用100倍油镜进行镜检，芽孢呈绿色，菌体呈红色(图18b)，yc9l菌可产芽孢。