一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂及标记方法与流程

1.本发明属于育苗标记技术领域，具体涉及一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂及标记方法。


背景技术：

2.标记-回捕方法对研究鱼类的洄游、种群大小、生长率和行为等具有重要作用，耳石是鱼类生长和早期生活史研究的重要载体。目前，放流增殖鱼苗标记方法有t-锚标法、金属线码标法、荧光胶体标记法、微卫星分子标记法、荧光物质标记法等。t-锚标法缺点：1)t-锚标法受标记鱼个体需要达到一定规格；2)标记工作量大，批量标记耗时多；3)且标记会对鱼体造成机械损伤，鱼体以感染细菌死亡；4)标记易脱落。金属线码标法缺点：1)标记鱼个体需要达到一定规格；2)标记工作量大，批量标记耗时多；3)且标记会对鱼体造成机械损伤，鱼体以感染细菌死亡。荧光胶体标记法缺点：1)标记鱼个体需要达到一定规格；2)标记工作量大，批量标记耗时多。微卫星分子标记法缺点：需要对回捕的鱼进行分子微卫星检测亲子关系，回捕检测工作量大，耗时多。西藏鱼类生长缓慢，西藏农业农村厅要求的增殖放流苗种规格为体长2.5-3.0cm；现有也有采用荧光染液进行标记，具体为将鱼苗放入含有荧光染液的水体中，使得荧光元素在耳石中沉积，达到标记的效果，但是采用现有技术中的荧光染液对双须叶须鱼进行标记后，导致双须叶须鱼大量死亡的情况发生，当降低荧光染液的浓度时，导致一定时间后，标记不明显，因此，现有技术中的方式均不适合双须叶须鱼。


技术实现要素：

3.针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂及标记方法，该标记方法可有效解决现有的标记方法存在的育苗死亡率大、标记效果差、标记保存时间短的问题。
4.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
5.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有荧光标记物、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内荧光标记物的质量浓度为200-280mg/l，当归提取物的质量浓度为30-50mg/l，黄芪提取物的质量浓度为40-70mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为40-70mg/l，栀子提取物的质量浓度为20-30mg/l。
6.进一步地，标记试剂内含有荧光标记物、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内荧光标记物的质量浓度为280mg/l，当归提取物的质量浓度为40mg/l，黄芪提取物的质量浓度为60mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为60mg/l，栀子提取物的质量浓度为30mg/l。
7.进一步地，荧光标记物为茜红素-s。
8.本技术中双须叶须鱼放流苗种的标记方法，包括以下步骤：取双须叶须鱼种苗，于标记前停食24h，然后，将双须叶须鱼种苗放入标记试剂中浸泡，标记试剂温度为12-13℃，标记试剂中鱼苗密度≤150尾/升，溶解氧≥6mg/l，氨氮＜0.1，亚硝酸＜0.005，ph值为8-9。
9.进一步地，双须叶须鱼为30日龄的鱼苗。
10.进一步地，双须叶须鱼在标记试剂中的浸泡时间为60-65h。
11.进一步地，标记过程中，每隔24h更换一次标记试剂。
12.本发明所产生的有益效果为：
13.本技术的标记试剂中添加的当归提取物可促进双须叶须鱼苗体内血液流动、循环，黄芪提取物可增强鱼苗的抵抗性，栀子提取物和鱼腥草提取物可凉血解毒，降低荧光标记物对鱼苗的毒性作用，上述提取物合用，通过加速血液循环、凉血解毒和增强抗性的作用提高鱼苗在高浓度荧光标记物中浸泡时的成活率；由于荧光标记物的浓度较高，其对鱼苗耳石的标记作用更强，使得标记过程耗时更短，标记的保存时间更长。
附图说明
14.图1为按照实施例3中的试剂和方法标记后，开始养殖时耳石的荧光标记效果；
15.图2为按照实施例3中的试剂和方法标记后，养殖1个月后耳石的荧光标记效果；
16.图3为按照实施例3中的试剂和方法标记后，养殖2个月后耳石的荧光标记效果；
17.图4为按照实施例3中的试剂和方法标记后，养殖4个月后耳石的荧光标记效果。
具体实施方式
18.下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
19.实施例1
20.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为200mg/l，当归提取物的质量浓度为30mg/l，黄芪提取物的质量浓度为40mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为40mg/l，栀子提取物的质量浓度为20mg/l。
21.双须叶须鱼放流苗种的标记方法，包括以下步骤：取30日龄的双须叶须鱼鱼苗，于标记前停食24h，然后，将双须叶须鱼种苗放入标记试剂中浸泡60h，标记试剂温度为12℃，标记试剂中鱼苗密度140尾/升，溶解氧7mg/l，氨氮0.08，亚硝酸0.004，ph值为8，每隔24h更换一次标记试剂。
22.实施例2
23.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为260mg/l，当归提取物的质量浓度为50mg/l，黄芪提取物的质量浓度为70mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为70mg/l，栀子提取物的质量浓度为30mg/l。
24.双须叶须鱼放流苗种的标记方法，包括以下步骤：取30日龄的双须叶须鱼鱼苗，于标记前停食24h，然后，将双须叶须鱼种苗放入标记试剂中浸泡65h，标记试剂温度为13℃，标记试剂中鱼苗密度130尾/升，溶解氧7mg/l，氨氮＜0.08，亚硝酸0.004，ph值为9，每隔24h更换一次标记试剂。
25.实施例3
26.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l，当归提
取物的质量浓度为40mg/l，黄芪提取物的质量浓度为60mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为60mg/l，栀子提取物的质量浓度为30mg/l。
27.双须叶须鱼放流苗种的标记方法，包括以下步骤：取30日龄的双须叶须鱼鱼苗，于标记前停食24h，然后，将双须叶须鱼种苗放入标记试剂中浸泡60h，标记试剂温度为13℃，标记试剂中鱼苗密度140尾/升，溶解氧7mg/l，氨氮0.08，亚硝酸0.004，ph值为9，每隔24h更换一次标记试剂。
28.对比例1
29.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l。
30.双须叶须鱼放流苗种的标记方法同实施例3。
31.对比例2
32.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l。
33.双须叶须鱼放流苗种的标记方法，包括以下步骤：取30日龄的双须叶须鱼鱼苗，于标记前停食24h，然后，将双须叶须鱼种苗放入标记试剂中浸泡96h，标记试剂温度为13℃，标记试剂中鱼苗密度140尾/升，溶解氧7mg/l，氨氮0.08，亚硝酸0.004，ph值为9，每隔24h更换一次标记试剂。
34.对比例3
35.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l，当归提取物的质量浓度为10mg/l，黄芪提取物的质量浓度为60mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为20mg/l，栀子提取物的质量浓度为10mg/l。
36.双须叶须鱼放流苗种的标记方法同实施例3。
37.对比例4
38.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l，当归提取物的质量浓度为60mg/l，黄芪提取物的质量浓度为60mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为80mg/l，栀子提取物的质量浓度为50mg/l。
39.双须叶须鱼放流苗种的标记方法同实施例3。
40.对比例5
41.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l，当归提取物的质量浓度为40mg/l，党参提取物的质量浓度为60mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为60mg/l，栀子提取物的质量浓度为30mg/l。
42.对比例6
43.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l，当归提取物的质量浓度为40mg/l，白术提取物的质量浓度为60mg/l，鱼腥草提取物的质量浓度为60mg/l，栀子提取物的质量浓度为30mg/l。
44.对比例7
45.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l，当归提取物的质量浓度为40mg/l，黄芪提取物的质量浓度为60mg/l，板蓝根提取物的质量浓度为60mg/l，金银花提取物的质量浓度为30mg/l。
46.对比例8
47.一种双须叶须鱼放流苗种标记试剂，标记试剂内含有茜红素-s、黄芪提取物、当归提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物，标记试剂内茜红素-s的质量浓度为280mg/l，当归提取物的质量浓度为40mg/l，黄芪提取物的质量浓度为60mg/l，黄芩提取物的质量浓度为60mg/l，蒲公英提取物的质量浓度为30mg/l。
48.试验例
49.分别按照实施例1-3和对比例1-8中的方法配置标记试剂，并按照其中的方法进行染色，每一组染色方法中鱼苗的数量为200尾，染色后分别单独将每一组内的鱼苗捞出后置于清水中暂养0.5h，暂养后移入长2.8m
×
宽0.5m
×
高0.25cm的平列槽中长期养殖，平列槽从一端进水，一端排水，水交换量为0.5h/次，养殖用水为曝气后的井水，水温13℃，溶解氧7mg/l，氨氮0.08，亚硝酸0.004，ph8.5。每天投喂两次，饵料为冰冻水蚯蚓，每天清理平列槽1次，统计各组死鱼数量1次并记录。
50.养殖前3个月每月取样1次，每次各试验组鱼各取3尾，于50mg/l ms-222麻醉剂中麻醉后，测量体长，体重；奥林巴斯显微拍照系统拍摄鳃盖骨，鳍条；解剖镜下取出耳石，蒸馏水洗净，奥林巴斯显微拍照系统拍照。按照无(-)、可见(+)、明显(++)、强烈(+++)记录耳石染色效果。
51.实验结果采用excel2010进行初步统计和作图；采用spss 19.0统计软件中one-way anova进行单因子方差分析，若差异显著，则采用duncan's进行多重比较，差异显著水平为p＜0.05。
52.上述实验结果具体见表1-2。
53.表1：实施例1-3和对比例1-8中不同标记方法的鱼苗在养殖一定时间后的死亡率(％)
[0054] 养殖15天养殖30天养殖45养殖60养殖90养殖120天实施例13.043.283.683.984.254.39实施例23.333.683.954.194.344.83实施例33.023.263.563.794.054.15对比例15.215.475.645.715.835.87对比例25.225.615.795.845.946.01对比例34.655.025.275.455.585.79对比例44.454.985.245.405.655.71对比例54.714.854.975.085.215.27对比例64.654.834.955.125.315.33对比例74.684.794.824.995.235.33对比例84.784.885.015.245.385.41
[0055]
通过上表中的数据可以看出，采用实施例1-3和对比例1-8中的方法标记后，双须叶须鱼幼苗在养殖过程中，不同时间节点的死亡率有较大差异，其中实施例1-3中的标记试剂和标记方法造成的死亡率最低，尤其是实施例3。
[0056]
将对比例1与实施例3相比，取消了当归提取物、黄芪提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物的添加后，导致双须叶须鱼鱼苗在后续养殖过程中的死亡率大大增加，证明上述药材提取物可增加双须叶须鱼对茜红素-s的抵抗性，进而可增加其成活率。
[0057]
将对比例2与实施例3相比，增加了鱼苗在标记试剂中的浸泡时间，由于茜红素-s会造成鱼苗死亡，浸泡时间增长，导致鱼苗在后续养殖过程中的死亡率增加。
[0058]
将对比例3、对比例4与实施例3相比，调整了当归提取物、黄芪提取物、鱼腥草提取物和栀子提取物的使用浓度，通过结果可以看出，浓度改变以后，鱼苗的死亡率也相应增加，证明上述提取物的用量对于提高鱼苗的成活率是至关重要的。
[0059]
将对比例5-8与实施例3相比，对比例5中将黄芪提取物替换为党参提取物，对比例6中将黄芪提取物替换为白术提取物，对比例7中将鱼腥草提取物替换为板蓝根提取物，将栀子提取物替换为金银花提取物，对比例8中将鱼腥草提取物替换为黄芩提取物，将栀子提取物替换为蒲公英提取物后，鱼苗的死亡率也相应增加，证明上述提取物之间具有相互作用关系，虽然替换后的提取物具有相似作用的作用，但是，对于促进双须叶须鱼的成活效果仍然较差。
[0060]
表2：实施例1-3和对比例1-8中不同试验方法耳石染色有效保存时间
[0061][0062]
通过上表中的内容可以看出，采用实施例1-3和对比例1-8中的标记试剂和标记方法对双须叶须鱼鱼苗进行标记后，养殖3个月后，双须叶须鱼耳石内的荧光标记仍然明显，养殖4个月后双须叶须鱼耳石内的荧光标记也仍然可见，证明采用实施例1-3和对比例1-8中的标记试剂和标记方法均具有较好的染色效果。
[0063]
将实施例3中方法养殖的双须叶须鱼中的耳石取出，观察耳石的标记效果。具体结果见图1-4。
[0064]
通过图1-4可以看出，开始养殖时，耳石内整体均存在荧光物质，养殖1个月后，耳石内的荧光物质减少，但依然明显可见；养殖2个月后，耳石内的荧光物质继续减少，但依然明显可见，养殖4个月后，耳石内的荧光物质继续减少，但依然可见。