一种虹鳟全雌三倍体规模化制种方法与流程

1.本发明涉及鱼类性别调控和倍性育种技术领域，特别是涉及一种虹鳟全雌三倍体规模化制种方法。


背景技术：

2.鱼类倍性育种(基因组加倍)是遗传育种工作的重点研究领域之一，通过遗传改良可有效降低生产成本。三倍体雌性鱼类，因其具有生长快、增加肉重、改进质量和饲养管理容易等优点，已成为国内外水产科学工作者的研究热点，自上世纪80年代以来，三倍体鱼类的人工诱导工作取得了长足进展，由于三倍体雌鱼的不育性对控制养殖鱼类的过度繁殖和保护天然种质资源也具有极其重要的意义。因此，国际上有关多倍体诱导的研究工作进展很快。
3.在鲑鳟类、鲆鲽类、罗非鱼等海、淡水鱼类中诱导出三倍体，在鲑科鱼类中，己获得了大西洋鲑、硬头鳟、虹鳟、细鳞大麻哈鱼、大鳞大麻哈鱼和美洲红点等三倍体。近年来国内也利用温度休克方法成功地诱导出了三倍体团头鲂、水晶彩鲫、真鲷、黑鲷、牙鲆和虹鳟。目前，物理方法(温度休克)制备全雌三倍体的技术已被广泛应用，但由于该项技术对于受精卵的损耗太大而只停留在科学研究层面。而国外主要是采用静水压力法制备虹鳟全雌三倍体，但该技术对于卵细胞减数分裂控制和制种参数精度要求非常高，目前国外制备虹鳟三倍体的倍化率仍不稳定，且一直停留在实验室水平，未实现规模化和标准化，更未实现全雌化生产。
4.我国多倍体育种理论和主要技术参数仍停留在小规模的科学研究层面，加之投入不足和重视度不够，技术尚未集成和熟化，尚未将主要的成果转化为核心生产力，导致全雌性三倍体虹鳟的规模化技术停滞。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种虹鳟全雌三倍体规模化制种方法，以解决现有技术无法实现虹鳟全雌三倍体批量生产的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.技术方案一：一种虹鳟全雌三倍体规模化制种方法，包括以下步骤：
8.(1)繁殖亲本配组：挑选不同品系或具有不同遗传背景的虹鳟雌鱼和伪雄鱼以4：1的比例分别移入室内暂养池内暂养；
9.(2)人工授精：采集暂养池中雌鱼卵子和伪雄鱼精液，进行人工授精，获取受精卵；
10.(3)压力处理：将所述受精卵放入压力为7000-8500psi的压力装置中，处理5-15分钟；
11.(4)受精卵孵化：压力处理结束后，立即将受精卵放到孵化器内流水孵化；
12.(5)取样检测：在所述受精卵达到100度日积温时开始测定受精率，达到180-200度日积温时开始检测三倍体率。
13.进一步地，步骤(1)中，所述伪雄鱼具有虹鳟全雌遗传背景。
14.进一步地，步骤(2)中，采集雌鱼卵子是先将雌鱼用麻醉剂麻醉3分钟，再挤压雌鱼腹部后将卵产入生理盐水中；采集伪雄鱼精液的过程中严格禁止水进入精液。
15.进一步地，所述麻醉剂为乙二醇苯醚。
16.进一步地，步骤(2)中人工授精的水温及受精卵在进行压力处理前的水温为9-12℃。
17.进一步地，步骤(3)中压力装置内的温度控制在9-11℃。
18.进一步地，步骤(3)中所述压力处理是按照人工授精的时间和水温确定压力起始时间和有效压力持续时间。
19.进一步地，所述压力起始时间为受精后25-45分钟，所述有效压力持续时间为9-15分钟，其中，所述有效压力持续时间包括压力升压时间1分钟。
20.进一步地，步骤(4)中孵化器的水温控制在8-12℃。
21.进一步地，步骤(2)-(4)中的环境温度控制在9-12℃。
22.本发明公开了以下技术效果：
23.本发明提供方法开发了基于体色标记的雌核发育技术，批量化创制全雌种质，再通过性别控制技术批量化诱导全雌种质为伪雄鱼，通过伪雄鱼与正常雌鱼杂交获得全雌受精卵，并利用本发明的核心压力参数实施静水压力制种，最终实现标准化、批量化生产虹鳟全雌三倍体制种。本发明实现了虹鳟全雌三倍体制种高倍化率和高成活率的最佳效果，雌性率高达99％，三倍体率超过95％，制种成活率超过85％，这三项关键制种指标达到国际领先水平，并有望将该技术成果进行转化落地，实现虹鳟全雌三倍体规模化和商业化制种，打破国外的技术壁垒，为我国虹鳟养殖业可持续发展提供种业保障。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为虹鳟全雌种质创制原理图；
26.图2为伪雄鱼制备技术路线图；
27.图3为实施例1三倍体率检测对比图。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
30.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.下面结合实施例对本发明提供的一种虹鳟全雌三倍体规模化制种方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
33.本发明精子培养液的配制是将3.7145g的nacl、1.3905g的kcl、0.1524g的mgcl2·
6h2o、0.2100g的nahco3加入到500ml蒸馏水制成溶液，再向该溶液中加入浓度为1n的naoh溶液，将该溶液的ph值调整到8.4。
34.实施例1
35.一：虹鳟全雌种质创制及伪雄鱼制备
36.(1)虹鳟全雌种质创制：
37.亲本选择，挑选生长速度快的雌性虹鳟作为母本，挑选雄性金鳟作为父本。金鳟精子遗传物质紫外线灭活：将金鳟精子稀释到精子培养液中，稀释比例1:100，在直径9cm的培养皿中放1ml稀释精液，然后在紫外线灯下照射，照射强度6μw/cm2，照射65s，收集照射后的精液达到100ml，放置于4℃冰箱中保存，待人工授精时使用；
38.人工授精：将紫外线灭活的精子与虹鳟卵子混合，立即加入清水，激活精子，并记录时间；
39.压力处理，抑制第二次减数分裂，诱导雌核发育：将受精卵放入压力为7000psi的压力装置中，处理9分钟，第二次减数分裂被抑制后，将诱导受精卵雌核发育，获得虹鳟全雌种质；
40.受精卵孵化与仔鱼破膜：压力处理结束后，立即将受精卵放到孵化器内流水孵化，直至达到全雌仔鱼上浮游泳。
41.虹鳟全雌种质创制原理图详见图1。本发明利用金鳟雄鱼与虹鳟雌鱼杂交，后代将全部为金黄体色。因为金鳟属于虹鳟的体色突变种，体色属于双显性遗传，因此后代均为金黄体色。利用金鳟的体色标记，可有效验证精子灭活成败，当有诱导雌核发育过程中，金鳟精液灭活不彻底，将有金黄体色后代出现，说明紫外线照射强度不够或照射时间不合适；当灭活后的精子人工授精后，子代体色均为黑色，说明金鳟精子灭活成功，全雌种质创制精准；
42.(2)伪雄鱼制备，伪雄鱼诱导：将上浮的全雌仔鱼进行单独培育，在开口驯化阶段，每公斤开口饲料中拌入1.5mg甲级睾丸酮(美国，sigma)，连续投喂60天，之后转为正常幼鱼饲料进行饲育；
43.伪雄鱼培育效果：当伪雄鱼发育至性成熟阶段，将抽检伪雄鱼诱导成功率，解剖查看精巢形态和输精管畅通情况判定培育效果。伪雄鱼制备技术路线图详见图2。
44.二、制种前准备
45.亲本年龄：雌性虹鳟亲本的最佳年龄为4龄以上(非初次性成熟个体)，性逆转雄性
(伪雄鱼)虹鳟亲本的最佳年龄为3龄。
46.亲本检测及成熟度鉴别：亲本检查：进入繁殖期后，每7天对亲鱼进行一次成熟情况检查，检查时动作要轻，防止对鱼体的机械损伤和冻伤，对已成熟的雌鱼应及时采卵，防止过熟。
47.成熟度鉴别：雌性亲本：腹部膨大而柔软，生殖孔红肿外突，用手倒提鱼观察，鱼腹部有明显的下坠，轻压腹部有卵粒流出；雄性亲本：腹部没有明显的膨大，肛门突出。
48.繁殖亲本配组：为防止近亲繁殖，雌雄亲本应选择不同品系或具有不同遗传背景的个体。将成熟亲本雌：雄比4：1的比例分别移入室内暂养池，暂养池要保持水流的畅通，尾排水的溶氧保持在6mg/l以上，防止亲鱼从暂养池跳出。
49.三、人工繁殖
50.采卵前准备：采卵室内避免阳光直射和强灯光，室内的气温要保持在4℃以上，采卵台进行环境消杀处理，所有使用器具进行高浓度碘制剂消毒。准备干燥水盆、干燥纯棉毛巾、200ml的量杯。配制完生理盐水、伪雄鱼精子培养液和麻醉剂(300ppm乙二醇苯醚)，并将其温度调整到和产卵水温一致。
51.伪雄鱼精液采集与精子培养：将在暂养池的伪雄鱼逐一宰杀，解剖后取出鹅卵石状精巢，分别进行机械破碎，并用精子培养液进行稀释，过滤后于量杯中4℃条件培养待用，30分钟后进行精子活力镜检，淘汰精子活力弱的和没有精子活力的精液，在精液采集中严格禁止水进入精液，将采集好的精液进行混精。
52.卵子采集：将干燥好的水盆中加入约500ml的生理盐水，放在采卵台。将亲鱼放在麻醉剂中麻醉3分钟，采卵人员挤压雌鱼腹部将卵产入有生理盐水的水盆中，每个脸盆中人工采集3-4尾亲鱼的卵子(15000-20000粒)。生理盐水的配制：将7.5g的nacl、0.2g的kcl、0.2g的cacl2·
2h2o和0.02g的nahco3加入到1000ml蒸馏水制成生理盐水。
53.人工授精：每个卵盆中的卵用生理盐水反复清洗，生理盐水要沿着盆壁缓慢倒入、倒出，将鱼卵中的破损卵、体腔液、粪便洗净即可。用生理盐水刚刚淹没鱼卵，用吸管加入20ml精液，用手轻轻搅拌1分钟后加入少量清水(沿着盆壁缓慢倒入)静止2分钟，用清水冲洗5次(沿着盆壁缓慢倒入、倒出)静置30分钟。授精水温为9℃。
54.四、三倍体制种方案
55.(1)将静置好的受精卵按照人工授精先后顺序，分别倒入4升小塑料桶中，做好标记号，将制种车间的温度控制在11℃；
56.(2)设计好压力处理的时间表，按照先后顺序依次将小桶中的受精卵提前倒入压力装置内胆中，等待压力处理；
57.(3)调整压力装置的升压时间为1分钟，装置的压力值为7000psi、处理时长为10分钟，将压力装置内的温度控制在9℃；
58.不同的人工授精时间和授精后压力持续时间详见表1:
59.表1授精精后时间与压力持续时间对照表
[0060][0061]
五、受精卵孵化
[0062]
将受精卵放置到立式孵化器的抽屉内，每个抽屉内约放15000粒卵，流水孵化，孵化器的水温控制在9℃。100度日积温时检测受精率，180度日积温时检测受精卵，可以进行三倍体倍性检测，并形成检测报告。
[0063]
三倍体倍性检测：受精率检测：当积温达到100度日时，任意取30粒卵放入鉴别液中，5分钟后肉眼见到有白色线状胚体的卵即为受精卵，根据受精卵所占比例计算出受精率(二次检测，求平均数获得受精率)；鉴别液组分为：7g氯化钠、50ml冰醋酸和1l蒸馏水。
[0064]
三倍体率检测：将制备的虹鳟三倍体发眼卵暂放在4℃条件下；将发眼卵用尖头镊子刺穿，用镊子夹住胚胎在pbs缓冲液中搅动清洗掉多余油脂，随后置于培养皿的细胞核染液中(cystaindna1step)，将体胚胎切碎、摇匀制成胚胎细胞悬浊液；用细胞核染液冲洗培养皿与胚胎细胞悬浊液混合，再用30μm孔径滤网对胚胎细胞混合悬浊液进行过滤；取滤液用30μm孔径滤网再过滤一次，获得检测样本；将染色虹鳟二倍体样本用倍性分析仪检测，并调整荧光信号值至100处设定为对照样本；将虹鳟三倍体样本染色后用倍性分析仪检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与对照样本峰值图比较，确定检测样本的倍性大小，详见图3，每个抽检批次随机检测30粒发眼卵，用检测为三倍体的数量占检测总量的比值计算三倍体率，通常三次检测取平均数为最终检测的三倍体率。
[0065]
经统计：本实施例的雌性率高达99％，三倍体率超过100％，制种成活率超过85％。
[0066]
实施例2
[0067]
本实施例除了调整以下步骤，剩余的步骤与实施例1一致。调整的步骤有：
[0068]
将授精水温调整为12℃、将受精卵放入压力器中的压力值调整为8000psi、压力处理时间调整为15分钟、压力器内的温度调整为11℃、制种车间的温度调整为12℃；将孵化器的水温调整为12℃。
[0069]
经统计：本实施例的雌性率为99％，三倍体率98％，制种成活率80％。
[0070]
实施例3
[0071]
本实施例除了调整以下步骤，剩余的步骤与实施例1一致。调整的步骤有：
[0072]
将性逆转雄性(伪雄鱼)虹鳟亲本的最佳年龄调整为3龄、将精子培养液的配制步骤中最终溶液的ph值调整为9.2、将授精水温调整为11℃、将受精卵放入压力器中的压力值调整为8500psi、压力处理时间调整为5分钟、压力器内的温度调整为11℃、制种车间的温度
调整为12℃；将孵化器的水温调整为12℃。
[0073]
经统计：本实施例的雌性率为99％，三倍体率97％，制种成活率80％。
[0074]
对比例1
[0075]
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例受精水温分别为7℃和14℃。其余步骤与实施例1相同。
[0076]
经统计：本对比例7℃的雌性率为95％，三倍体率55％，制种成活率80％；14℃的雌性率为95％，三倍体率50％，制种成活率30％。
[0077]
对比例2
[0078]
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例压力装置内的温度控制在6℃和14℃。其余步骤与实施例1相同。
[0079]
经统计：本对比例6℃的雌性率为90％，三倍体率50％，制种成活率78％；14℃的雌性率为95％，三倍体率70％，制种成活率28％。
[0080]
对比例3
[0081]
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例将受精卵放入压力器中的压力值调整为9000psi。其余步骤与实施例1相同。
[0082]
经统计：本对比例的雌性率为92％，三倍体率95％，制种成活率20％。
[0083]
对比例4
[0084]
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例的制种车间的温度控制在7℃和15℃。其余步骤与实施例1相同。
[0085]
经统计：本对比例7℃的雌性率为95％，三倍体率52％，制种成活率80％；15℃的雌性率为92％，三倍体率60％，制种成活率15％。
[0086]
对比例5
[0087]
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例受精卵在进行压力处理前的水温为8℃和15℃。其余步骤与实施例1相同。
[0088]
经统计：本对比例8℃的雌性率为90％，三倍体率53％，制种成活率82％；15℃的雌性率为92％，三倍体率65％，制种成活率10％。
[0089]
对比例6
[0090]
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例是分别将成熟亲本雌：伪雄鱼比3：1；雌：伪雄鱼比1：1；雌：伪雄鱼比2：1；雌：伪雄鱼比1：2；伪雄鱼比1：3的比例分别移入室内暂养池。其余步骤与实施例1相同。
[0091]
经统计：本对比例雌：伪雄鱼比3：1的雌性率为92％，三倍体率90％，制种成活率70％；雌：伪雄鱼比1：1的雌性率为80％，三倍体率92％，制种成活率60％；雌：伪雄鱼比1：2的雌性率为91％，三倍体率95％，制种成活率55％；雌：伪雄鱼比1：3的雌性率为95％，三倍体率95％，制种成活率49％。
[0092]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。