硫酸粘杆菌素在害虫防治中的应用

1.本发明属于农药技术领域，具体涉及硫酸粘杆菌素在害虫防治中的应用。


背景技术：

2.作为新近发现的外来入侵物种，草地贪夜蛾在我国迅速蔓延，对我国农业生产活动带来了很大的威胁和影响。大量使用传统化学农药对草地贪夜蛾进行整治，不仅会对环境和食物造成严重污染，而且草地贪夜蛾对多种农药已产生抗性，所以如今迫切需要寻求新的靶点，开发新型农药。
3.g4 dna高级结构(g4-dna，g4结构)是对经典dna双螺旋结构的补充，近年来越来越多的研究发现g4和i-motif结构(序列上与g4互补的另一种高级结构)在生物体内广泛存在，且在dna的复制、基因的转录、rna的翻译和端粒的保护等多种生物学过程中都发挥着重要的功能。在昆虫生命活动g4结构中发挥重要作用，调控昆虫等生物的生长发育，而这些参与基因转录调控的g4结构及其结合蛋白有望成为害虫防治的新靶标，其结合的小分子化合物可望作为新型农药的靶点发挥重要作用，具有广阔的市场前景。
4.硫酸粘杆菌素(分子式：c
52h98n16o13
·
2h2so4，cas号为1264-72-8)又名硫酸粘菌素、克利斯汀(colistin)、多粘菌素e(polymyxin e)、抗敌素等，白色或近白色粉末，无臭、味苦有引湿性，易溶于水，微溶于甲醇、乙醇，溶于丙酮、乙醚等，游离碱微溶于水，在ph3～7.5范围内稳定。硫酸粘杆菌素由多粘杆菌产生，对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，用于治疗革兰氏阴性菌引起的肠道疾病，用作饲料添加剂，且有明显促生长作用。目前未见硫酸粘杆菌素在害虫防治方面的应用。


技术实现要素：

5.本发明第一方面的目的，在于提供硫酸粘杆菌素或其盐在防治害虫中的应用。
6.本发明第二方面的目的，在于提供硫酸粘杆菌素或其盐在制备防治害虫的产品中的应用。
7.本发明第三方面的目的，在于提供硫酸粘杆菌素或其盐在制备g4-dna结合剂中的应用。
8.本发明第四方面的目的，在于提供硫酸粘杆菌素或其盐在制备推迟鳞翅目昆虫化蛹时间的产品中的应用。
9.本发明第五方面的目的，在于提供硫酸粘杆菌素或其盐在抑制类固醇激素生物合成通路中的应用。
10.本发明第六方面的目的，在于提供一种防治害虫的方法。
11.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
12.本发明的第一个方面，提供硫酸粘杆菌素或其盐在防治害虫中的应用。
13.优选地，所述害虫为鳞翅目昆虫。
14.进一步优选地，所述害虫为斜纹夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾和草地
贪夜蛾中的一种或多种。
15.更进一步优选，所述害虫为草地贪夜蛾。
16.优选地，所述硫酸粘杆菌素或其盐通过与害虫体内的g4结构结合达到防治害虫的目的。
17.优选地，所述硫酸粘杆菌素或其盐的含量为50～300μm；进一步为100～300μm；更进一步为200～300μm。
18.本发明的第二个方面，提供硫酸粘杆菌素或其盐在制备防治害虫的产品中的应用。
19.优选地，所述害虫为鳞翅目昆虫。
20.进一步优选地，所述害虫为斜纹夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾中的一种或多种。
21.更进一步优选，所述害虫为草地贪夜蛾。
22.优选地，所述产品杀虫剂或者杀虫药物。
23.优选地，所述产品可以制备成常规剂型使用，例如干粉、可湿性粉剂、乳油、微乳剂、糊剂、颗粒剂或悬浮剂。
24.优选地，所述硫酸粘杆菌素或其盐通过与害虫体内的g4结构结合达到防治害虫的目的。
25.优选地，所述硫酸粘杆菌素或其盐的含量为50～300μm；进一步为100～300μm；更进一步为200～300μm。
26.本发明的第三个方面，提供硫酸粘杆菌素或其盐在制备g4-dna结合剂中的应用。
27.优选地，所述硫酸粘杆菌素或其盐的含量为50～300μm；进一步为100～300μm；更进一步为200～300μm。
28.本发明的第四个方面，提供硫酸粘杆菌素或其盐在制备推迟鳞翅目昆虫化蛹时间的产品中的应用。
29.硫酸粘杆菌素或其盐在推迟鳞翅目昆虫化蛹时间中的应用。
30.硫酸粘杆菌素或其盐在制备促进鳞翅目昆虫变态发育的产品中的应用。
31.硫酸粘杆菌素或其盐在促进鳞翅目昆虫变态发育中的应用。
32.优选地，所述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾中的一种或多种；进一步为草地贪夜蛾。
33.优选地，所述硫酸粘杆菌素或其盐的含量为50～300μm；进一步为100～300μm；更进一步为200～300μm。
34.本发明的第五个方面，提供硫酸粘杆菌素或其盐在抑制类固醇激素生物合成通路中的应用。
35.硫酸粘杆菌素或其盐在制备抑制类固醇激素生物合成通路的产品中的应用。
36.优选地，所述硫酸粘杆菌素或其盐的含量为50～300μm；进一步为100～300μm；更进一步为200～300μm。
37.本发明的第六个方面，提供一种防治害虫的方法，包括将硫酸粘杆菌素或其盐施用于害虫或害虫栖息地。
38.优选地，将有效剂量的硫酸粘杆菌素或其盐施用于害虫或害虫栖息地。
39.本发明提供防治害虫的方法，包括将害虫、害虫的食品、害虫的生境或繁殖场(害虫正在生长或可以生长的土壤、区域、材料或环境，或者欲保护以免于害虫攻击或侵染的材料、栽培植物、植物繁殖材料(如种子)、土壤、表面或空间)用硫酸粘杆菌素或其盐处理。
40.一般而言，“有效量”意指实现对生长的可观察效果所需要的活性成分的量，所述可观察效果包括坏死、死亡、阻滞、预防和除去、破坏或者减少靶标有机体的存在和活性的效果。对于本发明所用的硫酸粘杆菌素或其盐来说，有效量可以变化。有效量的所述硫酸粘杆菌素或其盐也根据主要条件而变化，如希望的杀虫效果和持续时间、气候、靶标种类、所在地、施用模式等。
41.本发明的有益效果是：
42.本发明提供的硫酸粘杆菌素或其盐不仅能延迟害虫幼虫化蛹的时间，而且还能让害虫幼虫出现异常化蛹甚至是不能化蛹而死亡，具有杀虫的作用。
43.硫酸粘杆菌素或其盐与g4结构结合后会使得草地贪夜蛾体内多种代谢途径相关基因的下调以及固醇类激素生物合成相关基因的下调，使得草地贪夜蛾幼虫化蛹过程中不能正常蜕皮而死亡。
附图说明
44.图1为g4结构与硫酸粘杆菌素结合的圆二色谱图。
45.图2为不同处理组的草地贪夜蛾在180h内的死亡数量结果统计图。
46.图3为不同处理组的草地贪夜蛾在180h内的化蛹数量结果统计图。
47.图4为不同处理组的草地贪夜蛾的死亡率和化蛹率。
48.图5为不同处理组的草地贪夜蛾幼虫的对比图。
49.图6为实验组中的草地贪夜蛾幼虫异常化蛹实图。
50.图7为实验组以及对照组的草地贪夜蛾的差异表达的基因；其中a为对照组，b为实验组。
51.图8为实验组以及对照组的草地贪夜蛾的上调基因的go富集以及kegg富集结果。
52.图9为实验组以及对照组的草地贪夜蛾的下调基因go富集的前20条显著的go term。
53.图10为实验组以及对照组的草地贪夜蛾的下调基因kegg富集前20条显著的通路结果。
具体实施方式
54.现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
55.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
56.实施例1硫酸粘杆菌素与g4结构的相互作用
57.配制200μl g4检测液，其中，含有5μm dna探针(该dna探针可形成g4结构，其核苷酸序列为：gtgcggggcgcgagggggccgaggggcgggcaa(seq id no：1))、100mm kcl，50mm tris-hcl(ph7.4)；将配制好的g4检测液充分混匀后于95℃退火10min；结束后将其放置于95℃热水中，在室内缓慢降到室温(25℃)，至少需要4h，即可使dna探针形成g4结构；在已形成g4结
构的检测液中分别加入不同浓度的硫酸粘杆菌素(浓度分别为0μm、50μm、100μm和200μm)，于4℃过夜孵育后，置于圆二色谱仪中进行cd检测，检测条件为：将200μl待检样品加进cd检测石英比色皿，至于检测口(每次检测时石英比色皿方向不变)，调整波长220nm～350nm，带宽1.0nm，反应时间0.5s，扫描速度为100nm/min，重复扫描3次取平均值。
58.g4结构具有不同的构型，主要以连续g形成该结构的四边走向来区分。相邻的连续g链空间走向出现一致的情况称为平行型g4结构，平行g4结构在cd结果中具有一对典型的260nm附近正峰和240nm负峰。由图1中可以看出，当没有添加硫酸粘杆菌素的时候，cd结果显示出在265nm处有一个正峰，在240nm处有一个负峰，这是g4结构的特征峰，证明我们合成的dna探针能在体外形成g4结构，且为平行型g4结构。当添加不同浓度的硫酸粘杆菌素的时，g4结构的cd特征峰发生显著的改变，而且添加的硫酸粘杆菌素浓度越高，特征峰改变得越明显，表明由硫酸粘杆菌素可以与g4结构相结合，高浓度(200μm)与g4结构具有相当强烈的作用。
59.实施例2硫酸粘杆菌素对草地贪夜蛾的杀虫效果
60.在确定硫酸粘杆菌素能与g4结构结合后，我们开始探究硫酸粘杆菌素对使草地贪夜蛾杀虫效果，具体实验如下：
61.取40头6日龄的草地贪夜蛾幼虫，平均分成两组，每组各20头，分为实验组和对照组，实验组：每天早上10点以及下午5点对每头幼虫喷洒约50μl的120mm硫酸粘杆菌素溶液，直到草地贪夜蛾幼虫化蛹；对照组：每天早上10点以及下午5点对每头幼虫喷洒约50μl的水，直到草地贪夜蛾幼虫化蛹。两组草地贪夜蛾幼虫在正常培养条件下培养(湿度为26℃，相对湿度为60％，光周期为10h)，分别观察并记录每次喷洒后草地贪夜蛾幼虫的存活数量以及最后的化蛹数量。
62.通过观察(各组草地贪夜蛾的生长情况见图5)并统计对照组和实验组草地贪夜蛾幼虫的存活数量以及最后的化蛹数量，结果表明，对照组的草地贪夜蛾幼虫在180h内未出现死亡现象，死亡率为0％，喷洒硫酸粘杆菌素溶液的草地贪夜蛾幼虫在100h内也未出现死亡的情况，草地贪夜蛾幼虫均比较活泼，说明硫酸粘杆菌素对草地贪夜蛾的幼虫影响较小；当超过100h后，草地贪夜蛾开始进入化蛹期，对照组的草地贪夜蛾都能正常化蛹，随着时间的延长，化蛹数量持续增加，180h后20只草地贪夜蛾幼虫均成功化蛹，而喷洒硫酸粘杆菌素溶液的草地贪夜蛾幼虫相对于对照组草地贪夜蛾幼虫的化蛹时间推迟了约24h，且草地贪夜蛾从预蛹期开始逐渐出现死亡，死亡数量随着时间的延长逐渐增加，至180h共有12只草地贪夜蛾死亡，死亡率达到60％，仅6只草地贪夜蛾成功化蛹，化蛹成功率为45％(图2、图3和图4)；另外，实验组的草地贪夜蛾幼虫还出现了异常化蛹的现象(图6)。上述结果可以看出硫酸粘杆菌素不仅能使草地贪夜蛾幼虫化蛹的时间推后，更重要的是能让草地贪夜蛾幼虫异常化蛹甚至是不能化蛹而死亡，由此可以说明硫酸粘杆菌素对草地贪夜蛾的变态发育有一定的影响，而且从总体的死亡率以及化蛹率来看，硫酸粘杆菌素对草地贪夜蛾有一定的杀虫作用。
63.实施例3不同处理后的草地贪幼虫的基因表达
64.在实施例2的基础上，我们进一步对实验组和对照组的草地贪幼虫进行转录组测序，并对所得到的转录组数据进行分析，具体实验如下：取实验组和对照组末期的草地贪夜蛾各两头进行转录组测序，得到的转录组数据使用salmon进行基因进行定量分析，然后使
用deseq2对基因定量数据分析得实验组相对于对照组上调以及下调的基因及其数量，最后分别对上调和下调的基因进行go富集分析和kegg富集分析。
65.结果如图7所示，通过对对照组和实验组的草地贪幼虫的转录组数据进行分析，发现两组存在较多的差异表达的基因，而且在这些差异表达的基因中实验组的草地贪夜蛾幼虫相对于对照组的草地贪夜蛾幼虫大部分基因表现为其表达被下调了(图7)，表明g4结构参与基因的表达调控，而硫酸粘杆菌素与g4结构结合后影响了基因的表达。进一步对上调的基因和下调的基因进行go富集分析和kegg富集分析，我们发现下调基因前20条显著的go term大多都是为一些代谢过程(如蛋白水解、碳水化合物代谢以及单机体代谢等)中涉及的基因(图9)，而上调基因的go富集结构大多与表皮细胞的发育以及分化有关(图8)，这些结果提示草地贪夜蛾幼虫出现异常化蛹现象可能是由于表皮细胞的发育以及分化的基因被上调所以能化蛹，但是大多数代谢过程的基因被抑制导致旧的表皮不能正常蜕去，因此出现了异常化蛹的现象。而下调基因的kegg富集前20条显著的通路大多也是一些代谢通路(例如细胞色素p450对异种生物的代谢、视黄醇代谢、抗坏血酸和醛酸代谢等等)，除此之外，还存在一条类固醇激素生物合成通路(steroid hormone biosynthesis)被下调(图10)，其中，20-羟基蜕皮酮(20e)就是该类固醇激素生物合成通路中的一种，20e是一种蜕皮激素，20e在昆虫中能促进幼虫组织发生凋亡，在成虫组织的新生和昆虫蜕皮及蜕皮变态过程中扮演调控因子的角色，因此可以推测实验组中硫酸粘杆菌素与g4结构结合后使得类固醇激素生物合成通路被下调从而导致草地贪夜蛾幼虫在化蛹过程中不能正常蜕皮从而导致草地贪夜蛾幼虫死亡或者蜕皮异常的发生。
66.综上所述，硫酸粘杆菌素与g4结构结合后会使得多种代谢途径相关基因的下调以及固醇类激素生物合成相关基因的下调，使得草地贪夜蛾幼虫化蛹过程中不能正常蜕皮而死亡，表明硫酸粘杆菌素具有良好的杀虫作用。
67.上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。