一种桃金娘诱导愈伤再生成苗的方法

1.本发明涉及现代中草药栽培技术领域，特别是涉及一种桃金娘诱导愈伤再生成苗的方法。


背景技术：

2.桃金娘(rhodomyrtus tomentosa(ait.)hask)为桃金娘科桃金娘属常绿小灌木，别名岗稔、山稔、山旦仔、桃娘等，原产于我国东南部、南部、西南部以及亚洲热带和亚热带地区。作为传统中药材，主要以根、叶、果入药，是探索新型功能性药物的潜在资源。目前许多研究都集中在桃金娘提取物的功能特性上，这些提取物传统上用于对抗各种疾病，并具有保护植物免受生物或非生物胁迫的药理活性。此外，桃金娘可用于制作一些食品，例如葡萄酒、果酱和茶。桃金娘中含有大量挥发性萜类化合物，挥发油在我们的生活和健康中发挥着重要作用，如呼吸药物和香水等。
3.目前桃金娘处于野生资源阶段，随着人为、牲畜活动频繁，桃金娘生境屡遭破坏。同时由于对其过度挖掘，使个体数锐减，导致遗传多样性减少。虽然桃金娘医药、保健价值高，经济效益大，但因其种子结实、种子活力短、自然发芽率低和幼苗种群高度异质，进行大面积人工驯化栽培较难，故桃金娘仍处于野生状态，影响桃金娘栽培推广及深入研究。
4.因此，如何通过合适的外植体获得优质的胚性愈伤组织，然后增殖分化成新芽或新根等组织，建立桃金娘愈伤形成再生成苗体系，有利于实现苗木繁殖的同步化，快速高效地获得大量再生苗以促进实现人工栽培种植，进而将合理利用桃金娘的资源与保护生态地理多样性这二者完美结合亟待解决。此外，愈伤组织诱导和植物再生是基因转化研究其巨大特性的基础，也为今后桃金娘的进一步研究工作奠定了理论实践基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种操作简单、易于掌握，有利于开展桃金娘种苗扩繁的桃金娘诱导愈伤再生成苗的方法。
6.本发明的桃金娘诱导愈伤再生成苗的方法，包括以下步骤：
7.a、将无菌的桃金娘试管苗叶片或者茎段作为外植体接种至愈伤组织诱导培养基上诱导培养，得到愈伤组织；
8.所述的愈伤组织诱导培养基为ms+0.5～1mg/l 6-ba+0.05～0.1mg/l naa+0.005～0.01mg/l tdz+蔗糖+琼脂；
9.b、将所述愈伤组织接种至增殖分化培养基上增殖分化培养，先得到颗粒致密的愈伤组织，后逐渐形成丛生芽；
10.所述的增殖分化培养基为1/2ms+1～1.5mg/l 6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+蔗糖+琼脂；
11.c、将所述丛生芽分切并移入生根培养基上进行生根培养，得到再生的小苗；
12.所述的生根培养基为1/2ms+蔗糖+琼脂；
13.d、将高6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗3～5天后，从培养瓶中取出试管苗并洗去根部培养基，移栽到由腐殖质土和黄沙泥混合成的基质中；
14.所述的诱导培养的条件是光照强度1500～3000lx，16/8h光/暗条件，温度26～32℃；
15.所述的增殖分化培养的条件是光照强度1500～3000lx，16/8h光/暗条件，温度26～32℃；
16.所述的生根培养的条件是光照强度3000～5000lx，16/8h光/暗条件，温度26～32℃。
17.优选，所述的外植体是将无菌的桃金娘试管苗叶片沿叶片主脉方向进行刻伤痕处理，每个叶片刻伤痕处理的个数为2～3个，每个伤痕的长度为1～2mm，然后将处理的叶片作为外植体或者无菌的桃金娘试管苗茎段，将其切成1～2厘米作为外植体。
18.所述的愈伤组织诱导培养基优选为ms+0.5mg/l 6-ba+0.05mg/l naa+0.005mg/l tdz+30g/l蔗糖+琼脂5g/l。
19.所述的增殖分化培养基优选为1/2ms+1mg/l 6-ba+0.1mg/l naa+30g/l蔗糖+琼脂5g/l；
20.所述的生根培养基优选为1/2ms+30g/l蔗糖+琼脂5g/l。
21.所述的基质优选为由腐殖质土和黄沙泥按质量比3:1混合成。
22.优选，所述的诱导培养的条件是光照强度3000lx，16/8h光/暗条件，温度26℃；
23.所述的增殖分化培养的条件是光照强度3000lx，16/8h光/暗条件，温度26℃；
24.所述的生根培养的条件是光照强度5000lx，16/8h光/暗条件，温度26℃。
25.ms培养基是组培领域常规培养基，可以从商业公司购买到，而1/2ms是ms培养基中大量元素减半其他不变而配置的培养基。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.为了获得优质的胚性愈伤组织，在含有0.5mg/l 6-ba，0.05mg/lnaa，0.005mg/l tdz，30g/l蔗糖，琼脂5g/l的ms培养基上从嫩叶和茎中诱导愈伤组织，在含有1mg/l 6-ba，0.1mg/lnaa，30g/l蔗糖，琼脂5g/l的1/2ms培养基上可在60d内分化为不定芽，在30g/l蔗糖，琼脂5g/l组成的1/2ms生根培养基上的不定芽均能生根，将生根的再生植株移栽之后超过90％的小苗成活。桃金娘的试管苗的嫩叶和嫩茎均可作为外植体，幼苗嫩叶再生效果最好，愈伤增殖分化温度26℃结合光照强度3000lx和生根培养温度26℃结合光照强度5000lx效果最好，可减少愈伤出现玻璃化或褐化现象，此外不含植物外源激素的1/2ms培养基更适合生根，再生苗成活率可达到90％。
28.此外，本发明方法的操作简单、易于掌握，有利于开展桃金娘种苗扩繁的后续工作。
附图说明
29.图1是实施例1，实施例2，对比例1，对比例2和对比例3桃金娘的外植体的愈伤形成；
30.图2是实施例1和实施例2桃金娘愈伤增殖分化形成不定芽。
31.图3是实施例1和实施例2桃金娘再生植株的生根。
32.图4是实施例1桃金娘移栽成活的再生小苗。
具体实施方式
33.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
34.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
35.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
36.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
37.本实施方式提供一种桃金娘诱导愈伤再生成苗的方法，包括以下步骤：
38.(1)将无菌的桃金娘试管苗外植体接种至愈伤组织诱导培养基上诱导培养，得到愈伤组织；
39.(2)将所述愈伤组织接种至增殖分化培养基上增殖分化培养，先得到颗粒致密的愈伤组织，后逐渐形成丛生芽；
40.(3)将所述丛生芽分切并移入生根培养基上进行生根培养，得到再生的小苗；
41.(4)将高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗3～5天后,从培养瓶中取出试管苗并洗去根部培养基，移栽到由腐殖质土和黄沙泥混合成的基质中。
42.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
43.以下实施例涉及的无菌桃金娘试管苗来源：所用无菌的桃金娘试管苗来源于桃金娘种子无菌繁殖的小苗，桃金娘种子采自于广州华南植物园，种子采摘时间是2019年10月。
44.实施例1
45.(1)将无菌的桃金娘试管苗叶片沿叶片主脉方向进行刻伤痕处理，每个叶片刻伤痕处理的个数为2～3个，每个伤痕的长度为1～2mm，然后将处理的叶片接种至愈伤组织诱导培养基(ms，0.5mg/l 6-ba，0.05mg/lnaa，0.005mg/l tdz，30g/l蔗糖，琼脂5g/l，其配制方法在ms培养基中加入蔗糖、琼脂后灭菌消毒，然后待温度降低到45℃左右时，再加入过滤除菌的6-ba、naa和tdz溶液)上诱导培养(光照强度3000lx，16/8h光/暗条件，温度26℃)，得到愈伤组织；
46.(2)将所述愈伤组织接种至增殖分化培养基(1/2ms，1mg/l 6-ba，0.1mg/lnaa，30g/l蔗糖，琼脂5g/l，其配制方法在1/2ms培养基中加入蔗糖、琼脂后灭菌消毒，然后待温度降低到45℃左右时，再加入过滤除菌的6-ba、naa溶液)上增殖分化培养(光照强度3000lx，16/8h光/暗条件，温度26℃)，先得到颗粒致密的愈伤组织，后逐渐形成丛生芽；
47.(3)将所述丛生芽分切并移入生根培养基(1/2ms，30g/l蔗糖，琼脂5g/l，其配制方法在1/2ms培养基中加入蔗糖、琼脂后灭菌消毒)上进行生根培养(光照强度5000lx，16/8h
光/暗条件，温度26℃)，得到再生的小苗；
48.(4)将高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗3～5天后,从培养瓶中取出试管苗并洗去根部培养基，移栽到由腐殖质土和黄沙泥混合成的基质中。
49.上述培养基配置时需要经过高温灭菌消毒，添加的外源激素需经过过滤除菌后添加。
50.上述丛生芽分切在单芽3～5cm时。
51.上述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)均在无菌环境下操作。
52.上述移栽的基质由腐殖质土和黄沙泥按质量比3:1混合成。
53.实施例2
54.本实施例与实施例1的区别在于：步骤(1)中，外植体为无菌的桃金娘试管苗茎段，将其切成1～2厘米，接种至愈伤组织诱导培养基上，其他步骤相同。
55.对比例1
56.本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中，外植体为消毒的野外采摘的三～五年生桃金娘顶端嫩叶，其他步骤相同。
57.对比例2
58.本对比例与实施例1的区别在于，外植体为消毒的野外采摘的三～五年生桃金娘嫩茎，其他步骤相同。
59.对比例3
60.本对比例与实施例1的区别在于，外植体为消毒的野外采摘的三～五年生桃金娘花瓣，其他步骤相同。
61.对比例4
62.本对比例与实施例1的区别在于，外植体为消毒的野外采摘的三～五年生桃金娘花雄蕊，其他步骤相同。
63.对比例5
64.本对比例与实施例1的区别在于，愈伤诱导培养和增殖分化培养的光照强度1500lx。
65.对比例6
66.本对比例与实施例1的区别在于，愈伤诱导培养和增殖分化培养的光照强度1500lx，温度20℃。
67.对比例7
68.本对比例与实施例1的区别在于，愈伤诱导培养和增殖分化培养的温度为20℃。
69.对比例8
70.本对比例与实施例1的区别在于，愈伤诱导培养和增殖分化培养的光照强度1500lx，温度32℃。
71.对比例9
72.本对比例与实施例1的区别在于，愈伤诱导培养和增殖分化培养的温度为32℃。
73.对比例10
74.本对比例与实施例1的区别在于，生根培养基中添加0.5mg/l iba，其他步骤相同。
75.对比例11
76.本对比例与实施例1的区别在于，生根培养基中添加0.05mg/lnaa，其他步骤相同。
77.对比例12
78.本对比例与实施例1的区别在于，生根培养基中添加0.5mg/lnaa，其他步骤相同。
79.对比例13
80.本对比例与实施例1的区别在于，生根培养基中添加0.5mg/l iba和0.05mg/lnaa，其他步骤相同。
81.性能测试：
82.愈伤组织诱导率(％)＝愈伤组织数/接种外植体数
×
100
83.不定芽形成率(％)＝不定芽数/接种的愈伤组织数
×
100
84.植株再生频率(％)＝再生出芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数
×
100
85.生根率(％)＝生根的再生苗数/接种不定芽数
×
100
86.成活率(％)＝成活再生苗/移栽的再生植株数)
×
100
87.结果如图1-4和表1-3所示，在含有0.5mg/l 6-ba，0.05mg/lnaa，0.005mg/l tdz，30g/l蔗糖，琼脂5g/l的ms培养基上从嫩叶和茎中诱导愈伤组织，98.48％的嫩叶和96.93％的茎段可诱导出淡黄绿色、颗粒状愈伤组织，其中77.07％的嫩叶形成的愈伤组织在含有1mg/l 6-ba，0.1mg/lnaa，30g/l蔗糖，琼脂5g/l的1/2ms培养基上可在60d内分化为不定芽，愈伤增殖分化适合的温度为26～32℃，光强为3000lx，此外，在30g/l蔗糖，琼脂5g/l组成的1/2ms生根培养基上的不定芽均能生根，将生根的再生植株移栽之后超过90％的小苗成活。
88.表1
[0089][0090]
表2
[0091][0092]
表3
[0093][0094][0095]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0096]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。