一种清香型杀虫剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及农药技术领域，尤其涉及一种清香型杀虫剂及其制备方法。


背景技术：

2.害虫给作物造成严重损失，影响人类社会的安全发展。例如，棉铃虫是最具破坏性的农业害虫之一，它能对许多重要的经济作物产生破坏，造成了严重的经济损失。目前，杀虫剂是防治害虫最快速有效的方法，尤其是化学杀虫剂。然而，滥用杀虫剂不仅产生了抗药性问题，而且引起了一系列的环境和生态问题，因此，发现具有新型结构和作用方式的潜在杀虫剂已成为当前杀虫剂研究的热点。天然产物具有良好的环境相容性、多种生物活性、独特作用方式，在寻找更有效的新型杀虫剂时可以作为理想的模板化合物。但是天然产物也存在开发周期长、成本高、实施困难、效果差的缺点。
3.发明专利cn102754660b公开一种卫生杀虫剂的制备方法。包括有效成分为氯烯炔菊酯，并加入乳化剂、助溶剂、稳定剂、ph植物精油及水。该发明杀虫剂的配制方法为：先按质量分数的氯烯炔菊酯、乳化剂，助溶剂和稳定剂混合搅拌制成乳油，然后将乳油加入水中，边加边搅拌，最后加入植物精油充分搅匀直至澄清透明。该发明的水基型卫生杀虫剂以水替代有机溶剂，不含抛射剂，制备成本低廉，操作方便，生产储运安全性高。与现有技术相比该发明的水剂型卫生杀虫剂对居家驱蝇灭蚊具有更好的防效。但是该发明制备的杀菌组合物药效差，杀虫效果单一，无法显著降低病虫害。


技术实现要素：

4.有鉴于现有技术中天然杀虫剂药效差，杀虫效果单一的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种药效好，能阻止病虫生长繁殖的清香型杀虫剂。
5.为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
6.一种清香型杀虫剂，包括如下组分：功能剂、增效剂、表面活性剂、填料、溶剂。
7.优选的，一种清香型杀虫剂，包括如下重量百分比组分：30～45％功能剂、10～30％增效剂、1～5％表面活性剂、5～10％填料、30～50％溶剂。
8.功能剂中的清香成份对害虫有一定的吸引作用，活性杀菌成份也能阻碍害虫生长。
9.所述的功能剂为如下质量百分比组分组成：20～30％香叶醇、5～10％姜辣素、10～15％茴香脑、15～20％柠檬醛、5～10％异松油烯、15～25％月桂烯、1～5％乙酸芳樟酯、5～10％呋喃酮、0.1～1％薄荷醇、1～5％肉桂醛、1～3％香茅醛、1～5％芳樟醇混合而成。
10.所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钙、壬基酚聚氧乙烯醛和苯乙烯基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种的混合物。
11.所述填料为硅藻土、膨润土、凹凸棒土、淀粉、壳聚糖中的一种或几种的混合物。
12.所述溶剂选自乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇中的一种或几种的混合物。
13.所述的清香型杀虫剂采用如下方法制备得到：按配方称取各组分材料，将功能剂
和增效剂溶解在溶剂中，搅拌均匀，加入表面活性剂和填料，充分搅拌至均相液体，即得清香型杀虫剂。
14.所述增效剂的制备步骤如下：
15.s1、将无水四氢呋喃、三光气水溶液加入到2-氨基苯甲酸水溶液中，在室温下搅拌，然后倒入冰水中，过滤得到固体化合物；
16.s2、将步骤s1制备的固体化合物溶于无水n,n-二甲基甲酰胺中，然后加入氢化钠水溶液，搅拌反应，然后滴加碘甲烷水溶液，反应后，将反应混合物倒入冰水中，过滤收集固体得到预处理化合物；
17.s3、将5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐水溶液、原甲酸三乙酯、二甲基乙酰胺水溶液和步骤s2制备的预处理化合物混合加入到高压条件中，随后添加三氟乙酸水溶液和三乙烯二胺水溶液，搅拌反应，然后倒入冰水中，用乙酸乙酯提取溶液，并用饱和氯化钠盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后蒸发溶剂，用乙酸乙酯/石油醚柱色谱法对粗产物进行纯化，得到增效剂。
18.优选的，所述增效剂的制备步骤如下，所述份数均为重量份：
19.s1、将1～3份无水四氢呋喃、0.2～1份1.0～2mmol/l三光气水溶液加入到1～5份3～8mmol/l 2-氨基苯甲酸水溶液中，在室温下搅拌4～8h，然后倒入5～15份冰水中，过滤得到固体化合物；
20.s2、将步骤s1制备的固体化合物溶于3～8份无水n,n-二甲基甲酰胺中，然后在0～4℃加入0.05～0.2份2～6mmol/l氢化钠水溶液，反应混合物在0～4℃下搅拌20～40min，然后滴加0.3～0.8份3.0～3.5mmol/l碘甲烷水溶液，反应1～3h后，将反应混合物倒入5～15份冰水中，过滤收集固体得到预处理化合物；
21.s3、将0.1～0.5份1.5～3.0mmol/l的5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐水溶液、0.2～0.6份原甲酸三乙酯、0.1～0.3份1.0～3.0mmol/l二甲基乙酰胺水溶液和步骤s2制备的预处理化合物混合加入到高压釜中，高压釜中的压力为1～5mpa，随后添加0.2～0.6份1～3mmol/l三氟乙酸水溶液和0.3～0.5份2～4mmol/l三乙烯二胺水溶液，将反应混合物在80～110℃下搅拌反应3～8h，然后倒入5～15份的冰水中，用10～30份乙酸乙酯提取溶液三次，并用20～40份饱和氯化钠盐水洗涤，用8～15份无水硫酸钠干燥，然后蒸发溶剂，用乙酸乙酯/石油醚柱色谱法对粗产物进行纯化，得到增效剂。
22.本发明先将2-氨基苯甲酸与三光气反应得到固体化合物，然后在氢化钠存在下与碘甲烷反应得到预处理化合物，随后，通过串联酰胺化反应、脱羧反应、皮克特-施彭格勒反应构建连续的双苯环结构，得到增效剂。增效剂连续的双苯环结构对害虫具有一定的生长抑制作用，增效剂中的甲氧基取代基，可以提高杀灭害虫活性，原甲酸三乙酯作为载体连接的氟原子以1,3键位存在，具有较强的杀菌抑制性，ryrs和ip3rs是昆虫中枢神经元er中两种钙释放通道，增效剂可以作用于ryrs通道，引起中枢神经元内储存的钙离子的释放，导致病虫的生长繁殖受限。
23.昆虫的性信息素合成受到例如神经系统、激素类多肽、蛋白激酶、钙离子途径及其他诸多因素共同影响，本发明制备的增效剂能通过影响害虫的钙离子水平和激素水平，从而影响性信息素成分的合成，导致害虫发生滞育现象，降低繁殖速率。
24.香叶醇(反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇)，存在于牦牛儿苗科天竺葵属天竺葵、
禾水科香茅属芸香草、樟科木姜子属山鸡椒的果实山仓苍子、禾本科香茅、蔷薇科蔷薇属玫瑰的花和掌瑰等250多种植物中，香叶醇有着似玫瑰的花香香气。其来源有从天然精油中提取分离和半合成或全合成，广泛应用于药物、烟草、食品配料等领域。
25.姜辣素是生姜所具有的特殊辛辣味的主要呈味物质和功能性成分，其结构中均含有3-甲氧基-4-羟基苯基官能团，包括姜酚、姜烯酚、姜酮、姜醇类物质，具有抗菌、抗氧化、驱虫和抗癌等活性，在食品、医药、化妆品和保健品等行业有广泛的应用。
26.茴香脑有茴香特殊气味，并含有乙醛等物质，茴香脑主要用于日用化工(如牙膏等)、食品、烟草增香剂及医药等。
27.柠檬醛是一种常见的单萜化合物，天然柠檬醛由顺反两种构型的柠檬醛组成，常温下易挥发、不溶于水具有浓烈的柠檬香气。可用于制造柑橘香味食品香料，或合成异胡薄荷醇、羟基香茅醛和紫罗兰酮等其它香料，也是合成异植物醇、维生素的重要起始原料。
28.异松油烯存在于榄香树油、柏木油等植物中，呈木香气，可用于香水、食品香料、生物农药、化妆品、清洗剂等，高纯度的异松油烯可应用于工程塑料、精细化学品、医药等领域。
29.月桂烯具有令人愉快的甜香脂气味，是香料产业中重要的化学品原料和中间体，广泛应用于合成香茅醛、新铃兰醛和龙涎酮等多种名贵香料产品，同时也是合成维生素、驱虫剂，抗肿瘤活性物质等医药工业重要的原料。
30.乙酸芳樟酯又名乙酸沉香酯，具有类似铃兰、薰衣草等香精油的幽雅香气，可广泛用于配制皂用香精、香水香精、化妆品香精、食品香精等多种香精，用途非常广。
31.呋喃酮存在于草莓、燕麦、芒果、荔枝、麦芽、鹅莓、葡萄、菠萝等中。目前实际生产过程中比较多的是用丙酮醛和锌粉反应还原偶联得到3,4-二羟基-2,5-己二酮，再经环化制得呋喃酮。
32.薄荷醇具有特征的薄荷香味和清凉口感，广泛应用于糖果、牙膏和化妆品中，作为赋香剂。此外，在医药领域薄荷醇可作为刺激药，有清凉止痒的作用，内服还可作为祛风药，用于头痛、鼻、咽炎症。
33.肉桂醛是一种樟科的常绿植物。肉桂已经被全球广泛应用在食品，日化用品，香料，香精，医药等领域中。
34.香茅醛是一种香料，用于食用香精，配置柑橘和樱桃类香精，也用做调制皂用香精，为其他香料的原料，也用于合成薄荷醇。
35.芳樟醇，是无环单萜醇类化合物。天然芳樟醇主要来源于芳樟的根、茎、叶中，除此之外，芳樟醇还存在于茉莉、薰衣草等植物的挥发油中。芳樟醇带有浓青带甜的木青气息，似玫瑰木，既有紫丁香、铃兰与玫瑰的花香，又有木香、果香气息。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果：
37.1)采用植物提取物作为功能剂，散发的香味具有引诱害虫的作用，还含有灭虫化合物，相互配合，可防治多种不同种类的害虫，天然环保，能减轻对环境的污染；
38.2)通过2-氨基苯甲酸与三光气应得到固体化合物，然后在氢化钠存在下与碘甲烷反应得到预处理化合物，随后，与5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐和原甲酸三乙酯产生串联酰胺化反应、脱羧反应、皮克特-施彭格勒反应生成增效剂，能通过调节害虫钙离子的释放和激素水平，降低繁殖能力，产生杀灭害虫的效果，与功能剂复配能起到协同增
效的效果；
具体实施方式
39.实施例1
40.一种清香型杀虫剂的制备方法，包括如下步骤：将2.5kg功能剂和1.5kg增效剂溶解在6kg乙二醇中，搅拌均匀，加入0.3kg羧甲基纤维素钠和0.8kg硅藻土，充分搅拌至均相液体，即得清香型杀虫剂。
41.所述增效剂的制备步骤如下：
42.s1、将2kg无水四氢呋喃、0.5kg 1.8mmol/l三光气水溶液加入到3kg 5mmol/l 2-氨基苯甲酸水溶液中，在室温下搅拌6h，然后倒入10kg冰水中，过滤得到固体化合物；
43.s2、将步骤s1制备的固体化合物溶于5kg无水n,n-二甲基甲酰胺中，然后在0℃加入0.1kg 4.0mmol/l氢化钠水溶液，反应混合物在0℃下搅拌30min，然后滴加0.5kg 3.3mmol/l碘甲烷水溶液，反应2h后，将反应混合物倒入10kg冰水中，过滤收集固体得到预处理化合物；
44.s3、将0.4kg 2.0mmol/l的5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐水溶液、0.4kg原甲酸三乙酯、0.2kg 2.0mmol/l二甲基乙酰胺水溶液和步骤s2制备的预处理化合物混合加入到高压釜中，高压釜中的压力为3mpa，随后添加0.4kg 2mmol/l三氟乙酸水溶液和0.35kg3mmol/l三乙烯二胺水溶液，将反应混合物在100℃下搅拌反应6h，然后倒入10kg的冰水中，用20kg乙酸乙酯提取溶液三次，并用30kg饱和氯化钠盐水洗涤，用10kg无水硫酸钠干燥，然后蒸发溶剂，用乙酸乙酯/石油醚柱色谱法对粗产物进行纯化，得到增效剂。
45.所述功能剂为0.5kg香叶醇，0.2kg姜辣素，0.3kg茴香脑，0.4kg柠檬醛，0.2kg异松油烯，0.4kg月桂烯，0.1kg乙酸芳樟酯、0.2kg呋喃酮、0.02kg薄荷醇、0.08kg肉桂醛、0.05kg香茅醛、0.05kg芳樟醇混合而成。
46.实施例2
47.一种清香型杀虫剂的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述增效剂的制备方法不一致。
48.所述增效剂的制备方法如下：
49.s1、将2kg无水四氢呋喃加入到3kg 5mmol/l 2-氨基苯甲酸水溶液中，在室温下搅拌6h，然后倒入10kg冰水中，过滤得到固体化合物；
50.s2、将步骤s1制备的固体化合物溶于5kg无水n,n-二甲基甲酰胺中，然后在0℃加入0.1kg 4.0mmol/l氢化钠水溶液，反应混合物在0℃下搅拌30min，然后滴加0.5kg 3.3mmol/l碘甲烷水溶液，反应2h后，将反应混合物倒入10kg冰水中，过滤收集固体得到预处理化合物；
51.s3、将0.4kg 2.0mmol/l的5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐水溶液、0.4kg原甲酸三乙酯、0.2kg 2.0mmol/l二甲基乙酰胺水溶液和步骤s2制备的预处理化合物混合加入到高压釜中，高压釜中的压力为3mpa，随后添加0.4kg 2mmol/l三氟乙酸水溶液和0.35kg3mmol/l三乙烯二胺水溶液，将反应混合物在100℃下搅拌反应6h，然后倒入10kg的冰水中，用20kg乙酸乙酯提取溶液三次，并用30kg饱和氯化钠盐水洗涤，用10kg无水硫酸钠干燥，然后蒸发溶剂，用乙酸乙酯/石油醚柱色谱法对粗产物进行纯化，得到增效剂。
52.所述功能剂的制备方法与实施例1相同。
53.实施例3
54.一种清香型杀虫剂的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述增效剂的制备方法不一致。
55.所述增效剂的制备方法如下：
56.s1、将2kg无水四氢呋喃和0.5kg 1.8mmol/l三光气水溶液混合，在室温下搅拌6h，然后倒入10kg冰水中，过滤得到固体化合物；
57.s2、将步骤s1制备的固体化合物溶于5kg无水n,n-二甲基甲酰胺中，然后在0℃加入0.1kg 4.0mmol/l氢化钠水溶液，反应混合物在0℃下搅拌30min，然后滴加0.5kg 3.3mmol/l碘甲烷水溶液，反应2h后，将反应混合物倒入10kg冰水中，过滤收集固体得到预处理化合物；
58.s3、将0.4kg 2.0mmol/l的5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐水溶液、0.4kg原甲酸三乙酯、0.2kg 2.0mmol/l二甲基乙酰胺水溶液和步骤s2制备的预处理化合物混合加入到高压釜中，高压釜中的压力为3mpa，随后添加0.4kg 2mmol/l三氟乙酸水溶液和0.35kg3mmol/l三乙烯二胺水溶液，将反应混合物在100℃下搅拌反应6h，然后倒入10kg的冰水中，用20kg乙酸乙酯提取溶液三次，并用30kg饱和氯化钠盐水洗涤，用10kg无水硫酸钠干燥，然后蒸发溶剂，用乙酸乙酯/石油醚柱色谱法对粗产物进行纯化，得到增效剂。
59.所述功能剂的制备方法与实施例1相同。
60.实施例4
61.一种清香型杀虫剂的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述增效剂的制备方法不一致。
62.所述增效剂的制备方法如下：
63.s1、将2kg无水四氢呋喃、0.5kg 1.8mmol/l三光气水溶液加入到3kg 5mmol/l 2-氨基苯甲酸水溶液中，在室温下搅拌6h，然后倒入10kg冰水中，过滤得到固体化合物；
64.s2、将步骤s1制备的固体化合物溶于5kg无水n,n-二甲基甲酰胺中，然后在0℃加入0.1kg 4.0mmol/l氢化钠水溶液，反应混合物在0℃下搅拌30min，然后滴加0.5kg 3.3mmol/l碘甲烷水溶液，反应2h后，将反应混合物倒入10kg冰水中，过滤收集固体得到预处理化合物；
65.s3、将0.4kg 2.0mmol/l的5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐水溶液、0.2kg 2.0mmol/l二甲基乙酰胺水溶液和步骤s2制备的预处理化合物混合加入到高压釜中，高压釜中的压力为3mpa，随后添加0.4kg 2mmol/l三氟乙酸水溶液和0.35kg 3mmol/l三乙烯二胺水溶液，将反应混合物在100℃下搅拌反应6h，然后倒入10kg的冰水中，用20kg乙酸乙酯提取溶液三次，并用30kg饱和氯化钠盐水洗涤，用10kg无水硫酸钠干燥，然后蒸发溶剂，用乙酸乙酯/石油醚柱色谱法对粗产物进行纯化，得到增效剂。
66.所述功能剂的制备方法与实施例1相同。
67.对比例1
68.一种清香型杀虫剂的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述增效剂的制备方法不一致。
69.所述增效剂的制备方法如下：
70.s1、将2kg无水四氢呋喃倒入10kg冰水中，过滤得到化合物；
71.s2、将步骤s1制备的化合物溶于5kg无水n,n-二甲基甲酰胺中，然后在0℃加入0.1kg 4.0mmol/l氢化钠水溶液，反应混合物在0℃下搅拌30min，然后滴加0.5kg 3.3mmol/l碘甲烷水溶液，反应2h后，将反应混合物倒入10kg冰水中，过滤收集固体得到预处理化合物；
72.s3、将0.4kg 2.0mmol/l的5,6-二乙基-2,3-二氢-1h-茚-2-胺盐酸盐水溶液、0.2kg 2.0mmol/l二甲基乙酰胺水溶液和步骤s2制备的预处理化合物混合加入到高压釜中，高压釜中的压力为3mpa，随后添加0.4kg 2mmol/l三氟乙酸水溶液和0.35kg 3mmol/l三乙烯二胺水溶液，将反应混合物在100℃下搅拌反应6h，然后倒入10kg的冰水中，用20kg乙酸乙酯提取溶液三次，并用30kg饱和氯化钠盐水洗涤，用10kg无水硫酸钠干燥，然后蒸发溶剂，用乙酸乙酯/石油醚柱色谱法对粗产物进行纯化，得到增效剂。
73.所述功能剂的制备方法与实施例1相同。
74.对比例2
75.一种清香型杀虫剂的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：不添加增效剂。
76.对比例3
77.一种清香型杀虫剂的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：不添加功能剂。
78.测试例1
79.棉蚜田间药效测试
80.供试植物采用常规非转基因棉花。整块实验地位于湖北黄冈，该实验地土质均一，地势平缓，排灌优良。采用随机区组设计安排实验,将实验地分为8个大组，每个大组分成3个小组，共24个小组，将实施例和对比例的试样，加水配置成60g/l的喷洒农药，设置对照组，对照组采用清水，每组试样随机抽取3个小组的实验地，每个小组面积64平方米。棉花株距0.5米，小组之间采用塑料膜隔开。在晴朗天气，采用36g/公顷的量进行喷洒，并于喷药后的1d和5d各调查一次。调查对象为棉蚜。调查方法为五点取样法，分别于每个小区的东、南、西、北中取五个点，每点随机选取5株植株，调查统计每株植株上棉蚜的数量，取平均值。采用常规棉田管理方式，施药5d得虫口减退率和防治效果采用如下公式计算：
81.虫口减退率(％)＝[(防治区施药前虫口数-防治区施药后虫口数)
÷
防治区施药前虫口数]
×
100％
[0082]
防治效果(％)＝[(防治区虫口减退率-对照区虫口减退率)
÷
(1-对照区虫口减退率)]
×
100％
[0083]
测试结果见表1
[0084]
表1：棉蚜田间药效测试结果
[0085]
方案施药前施药1d施药5d虫口减退率防治效果实施例152923010380.5％87.5％实施例252731519563.0％76.2％实施例351530118963.3％76.4％实施例453832120462.1％75.6％
对比例155043834138.0％60.1％对比例252542433037.1％59.6％对比例352141130242.0％62.7％对照组509569792-55.6％ [0086]
从表1的测试结果可以看出，实施例1制备的清香型杀虫剂对棉蚜的田间药效最好，可能原因在于本发明先将2-氨基苯甲酸与三光气反应得到固体化合物，然后在氢化钠存在下与碘甲烷反应得到预处理化合物，随后，通过串联酰胺化反应、脱羧反应、皮克特-施彭格勒反应构建连续的双苯环结构，得到增效剂。增效剂的双苯环结构对害虫具有一定的生长抑制作用，增效剂中的甲氧基取代基，可以提高杀幼虫活性，原甲酸三乙酯作为载体连接的氟原子以1,3键位存在，具有较强的杀菌抑制性，能引起中枢神经元内储存的钙离子的释放，导致病虫的生长受限，而且实施例1比实施例3的防治效果好，可能原因在于功能剂中的清香成份对棉蚜有一定的吸引作用，活性杀菌成份也能阻碍棉蚜生长。
[0087]
测试例2
[0088]
棉铃虫交配试验
[0089]
试验对象为三日龄未交配的雌雄蛾，试验分成8组。每组为30头雄蛾、30头雌蛾。将所有成虫置于养虫纱笼(1.2mx0.8mx0.8m)内。将实施例和对比例的杀虫剂配置成60g/l，将棉叶在杀虫剂中浸渍，对照组采用清水浸渍，然后用滤纸将多余药液吸除，纱笼内放置50g处理后棉叶。在暗室内进行，每隔1小时观察一次，观察24次，观察使用红光手电筒(光强0.3lux)，若有雄蛾已经于雌蛾发生交配行为，则立马将其从养虫纱笼内移走，并计数。测试结果如表2所示。
[0090]
表2：交配试验测试结果
[0091]
试验方案交配对数实施例15实施例28实施例37实施例49对比例113对比例214对比例313对照组23
[0092]
(交配对数越少，说明杀虫剂对棉铃虫交配的抑制作用越大)
[0093]
从表2的测试结果看出，实施例1的杀虫剂对棉铃虫交配的抑制作用最大，可能原因在于雌蛾本身性信息素释放量就很不稳定，昆虫的性信息素合成受到例如神经系统、激素类多肽、蛋白激酶、钙离子途径及其他诸多因素共同影响，本发明制备的增效剂能通过影响棉铃虫的生长发育和钙离子水平，从而影响性信息素成分的合成，棉铃虫发生滞育现象，降低繁殖速率。
[0094]
测试例3
[0095]
钙离子的测定
[0096]
采用葡萄糖4g/l，蔗糖24g/l，果糖2.5g/l，脯氨酸3.3g/l，质量占比13％胎牛血
清，质量占比1.3％酵母提取液，配置成培养液。
[0097]
将8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.5g磷酸氢二钠、0.25磷酸二氢钾溶于950ml蒸馏水，用1mol/l的盐酸或1mol/l的氢氧化钠水溶液调ph至7.2，加蒸馏水定溶至1l。高压蒸汽灭菌锅120℃灭菌20min，制备成pbs缓冲液，放至室温后保存于4℃冰箱。
[0098]
将高温灭菌的pbs缓冲液在4℃冰箱中预冷。将芽孢杆菌放入盛有1.5ml预冷pbs的离心管中，在离心管中加入1ml 0.2％的木瓜蛋白酶，30℃保存10min，随后1000rpm离心4～6min，吸走木瓜蛋白酶，加入配置培养液静置5min。然后用培养液洗2遍，小心吸去培养液，重新加入1ml的培养液，用100μl枪头轻轻吹打使成悬液，用计数器在显微镜下对悬液计数，将悬液浓度调至3
×
106个/ml，用移液枪吸取150μl悬液接种到培养皿中，将培养皿置于恒温培养箱中，加入2～4ml的培养液，将实施例和对比例试样加水配置成16g/l，滴加8μl到培养皿中，30℃培养，培养时间为2d，采用培养液清洗2遍，进行钙离子测试。
[0099]
钙离子测试利用离子比例成像系统测量并记录，设置激发光两个分别为340nm和380nm，发射光为510nm。记录软件为metaimagingseries7.5中的metaflour软件，设置测量时间间隔为3s，开始测量并记录目标细胞的340/380的ratio值。因ratio值与钙离子浓度具有直接对应的关系，即可直接反应钙离子浓度的高低。
[0100]
每个实施例和对比例试样测试三次，取平均值。测试结果见表3。
[0101]
表3：钙离子的的测试结果
[0102][0103][0104]
从表3的测试结果可以看出，实施例1的ratio值最低，说明芽孢杆菌内的钙离子流失最为严重，原因可能在于本发明通过合成增效剂能引起中枢神经元内储存的钙离子的释放，激活钙通道，将储存的钙离子从芽孢杆菌中释放到体外，导致失活，增强杀虫效果。