一种提高高抗性淀粉水稻低世代育种效率的方法与流程

1.本发明属于水稻育种领域，具体涉及一种提高高抗性淀粉水稻低世代育种效率的方法。


背景技术：

2.抗性淀粉(resistant starch，简称rs)是指“在健康个体的小肠中不能被吸收的淀粉或淀粉降解产物”(欧洲rs协会euresta定义)。抗性淀粉有着重要的生理功能，能够降低餐后血糖和胰岛素应答，提高机体对胰岛素的敏感性，预防便秘和结肠癌的发生，降低血清中胆固醇和甘油三酯含量，降低和控制体重，促进矿物质吸收。通过筛选和鉴定高抗性淀粉含量的水稻遗传资源，提供具有高抗性淀粉含量的水稻品种，来改善人们的饮食结构是治疗和预防糖尿病等文明病发病的最经济有效的手段之一。
3.上海市农业科学院作物栽培育种研究所利用化学诱变和小孢子培养技术并结合常规育种技术，培育了高抗性淀粉粳稻新品种
‘
降糖稻1号’，并与相关企业合作进行了产业化开发，缓解了糖尿病人吃饭难、吃不饱饭的难题。上海市农业科学院作物栽培育种研究所以
‘
降糖稻1号’为研究对象，定位了控制水稻rs含量的主效基因sbe3-rs，并进行了功能互补验证，该突变基因在对应于水稻淀粉分支酶sbe3基因第16个外显子的第105位处具有t
→
c的碱基突变，并且针对该位点开发了多个功能标记分子标记。
4.根据高抗性淀粉性状基因的遗传特点和与垩白率、垩白度等性状间的高度相关关系以及利用已开发的caps/spei分子标记，建立了高抗性淀粉含量的水稻分子育种技术体系。该团队以
‘
降糖稻1号’为高抗性淀粉性状的工体亲本，成功选育了功能性和高产优质兼顾的新高rs含量的水稻品系
‘
优糖稻2号’和
‘
优糖稻3号’。但是优糖稻仍然存在食味差、抗逆性差等问题，通过遗传育种方法继续改良优糖稻食味、提高抗逆性等综合农艺性状具有重要意义。
5.杨瑞芳等(核农学报，2015，29(12)：2259-2267)首次提出利用对杂交群体早世代籽粒垩白特性挑选淘汰大部分低抗性淀粉单株，同时结合分子标记辅助选择，提高高抗性淀粉水稻品种选育效率。f1种植获得性状分离的f2种子，高抗性淀粉籽粒垩白度比较高，挑选垩白粒种植成小区，后代获得纯合高抗性淀粉基因型概率大大提高，通过人为挑选垩白度》50％的f2籽粒中纯合高抗性淀粉单株比率为30.6％。
6.抗性淀粉含量测定主要应用megazyme公司提供的rs含量测定试剂盒(megazyme,co.wicklow,ireland)，方法略有改进。具体步骤为：准确称取100mg米粉样品，小心放入带螺旋盖的塑料试管中，依次加入α-胰淀粉酶反应液和淀粉葡萄糖苷酶(agm)，37℃震荡孵育16小时，非rs被溶解，水解成d-葡萄糖；孵育结束后加入99％乙醇终止反应；离心上述溶液，弃上清，底部残留絮状团即为样品中的rs，再用50％乙醇洗涤沉淀；倒置离心管，沉淀干燥后用2mol
·
l-1氢氧化钾溶解沉淀，并加入agm，置于60℃水浴中孵育1h，最后用d-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂(gopod)试剂测定葡萄糖含量，并计算rs含量。抗性淀粉的测定过程复杂、耗时长、成本高，成为高抗性淀粉水稻育种的限制因素。f1低世代(10-18株种
植)混合收获获得f2代种子，经过人工挑选高垩白粒，一个组合需要1-2个小时挑选，通过人工挑选高垩白度籽粒费时，耗时，成本高。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种提高高抗性淀粉水稻低世代育种效率的方法，克服现有高抗性淀粉水稻新品种选育过程中低世代分离群体高抗性淀粉纯合单株比例低，人工挑选高垩白籽粒提高纯合单株比例方法费时、费力、高成本的缺点，实现了低世代快速筛选高抗性淀粉含量纯合单株，有效提高了含sbe3-rs基因型高抗性淀粉水稻品种选育的育种效率，节约了育种费用，可以快速、高效地进行大批量操作，获得优质高抗性淀粉水稻种质。
8.为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种提高高抗性淀粉水稻低世代育种效率的方法，包括以下步骤：
10.1)以含sbe3-rs基因纯合型的高抗性淀粉水稻品种为供体亲本，与另一种优质抗病水稻品种杂交，得f1代种子；所述优质抗病水稻指具备株型紧凑、植株健壮、产量高、穗大粒多、米质优性状的水稻，抗病指抗稻瘟病；
11.2)种植f1代种子，按组合收获，得f2代种子，对f2代种子进行水选，即将待选种子置于水中，保留悬浮的种子，晾晒干至含水量达12-14％，f2籽粒中纯合高抗性淀粉单株比率为50％-70％；
12.3)种植经水选中选的f2种子，选取综合农艺性状优良的单株，按单株收获，得f3种子；
13.4)分单株将获得的f3种子脱糙米，筛选糙米垩白率在70％以上的单株种子保留，无需分子标记检测，种植成小区，每个小区50-100株，进行稻瘟病田间抗性鉴定，选择符合育种目标的综合农艺性状优良的株系，再从中选株系中选择优良单株，按照单株收获，得f4代种子；
14.5)按照步骤4)的方式连续种植，直到获得f7代种子，选择标准同步骤4)，种植f7种子后在苗期进行sbe3-rs基因的kasp分子标记检测，混合收获单株种子，同时测定抗性淀粉含量，即获得稳定的符合育种目标的高抗性淀粉改良品种。
15.优选地，步骤1)中，所述优质抗病水稻指具备株型紧凑、植株健壮、产量高、穗大粒多、米质优、抗稻瘟病的水稻。
16.又，步骤1)中，所述高抗性淀粉水稻品种为
‘
优糖稻’，所述优质抗病水稻为
‘
s08-18’、
‘
sl-24’、
‘
沪稻89’。
17.优选地，步骤4)中，进行稻瘟病田间抗性鉴定时，以人工接种为主，自然诱发为辅。
18.又，步骤5)中，获得的高抗性淀粉水稻品种抗性淀粉含量大于10％。
19.常规水稻品种在种植过程中，通常会通过盐水选种的方法，挑选籽粒饱满的种子，播下去，让幼苗发育完善，进一步长成壮苗。发明人研究发现，含sbe3-rs基因纯合的高抗性淀粉水稻由于籽粒淀粉结构粒间结构疏松，透光性不好，比重小，籽粒具有高垩白度的特点，通过清水水选保留大部分悬浮籽粒，以期提高f2籽粒的高抗性淀粉基因纯合型比率。
20.本发明通过在低世代水选方法，高效率获得分离群里高垩粒，在选育低世代无需做分子标记检测和抗性淀粉含量测定，仅田间根据综合农艺性状筛选，室内进行垩白粒率调查，在高世代稳定品系最后进行分子标记检测和抗性淀粉含量测定，大大提高了高抗性
淀粉水稻新品种选育的育种效率，在低世代育种过程中就可获得高纯合型比率，纯合型比率为54.65％-63.16％。
21.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
22.本发明利用含sbe3-rs基因的高抗性淀粉水稻为供体亲本，进行优质高抗性淀粉水稻品种的选育，通过杂交育种方法，对杂交后代f1混合收获，得到f2种子；充分利用高抗性淀粉水稻籽粒高垩白度特性，籽粒淀粉颗粒内部有空隙，比重低，进行水选，将悬浮的籽粒分离出来，晾干水分含量到12-14％获得f2种子，无需分子标记检测，获得的高抗性淀粉纯合单株比率未水选的种子平均提高了4-8倍。
23.本发明中，在对f2代到f6代种子的选育过程中，均利用表型进行筛选，分单株脱糙米，保留糙米垩白率70％以上的单株，无需分子标记检测，直至获得f7代种子后才利用kasp分子标记检测，与现有技术中从f2代开始便以人工筛选结合分子标记检测的筛选方法相比，大大减少了分子标记检测的使用，节省了人力及选育时间。
24.本发明的三个杂交组合的f2种子通过水选f2籽粒中纯合高抗性淀粉单株比率平均达到58.65％，与人工挑选高垩白度(》50％)籽粒的育种效率30.6％相比，提高近2倍，同时，本发明的挑选方法更加简单快速，水选效率高，平均10分钟可以挑选一个组合，大大节省人力，成本低。
25.本发明的育种方法大大提高了高抗性淀粉水稻低世代抗性淀粉基因型纯合单株获得率，与抗性淀粉f2代实物田间筛选群体大、中选率低相比，低世代获得纯合型比率大大提高，实现了低世代快速筛选高抗性淀粉含量纯合单株，有效提高了含sbe3-rs基因型高抗性淀粉水稻品种选育育种效率，节约了育种费用。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中水选分离的悬浮中选种子外观图。
27.图2为本发明实施例1中水选分离的沉底弃选种子外观图。
具体实施方式
28.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
29.实施例1分别水选不同杂交组合f1混合收获的f2种子
30.以含sbe3-rs纯合基因型的高抗性淀粉水稻品种
‘
优糖稻’为供体亲本，与3个具有优良食味常规水稻品种杂交，3个品种分别为
‘
s08-18’、
‘
sl-24’、
‘
沪稻89’，种植f1代，成熟期分别混合收获f1种子获得f2代种子。
31.把f2代种子放到清水里，比较饱满的比重大的种子都沉在水底，高抗性淀粉纯合型籽粒因为密度较小，会悬浮起来，分别收集悬浮的种子和对应的沉在水底种子保留备用。
32.将悬浮的种子和沉在水底的种子脱糙米调查垩白率，外观见图1-2，悬浮种子的垩白粒率超过80％，同时包含一些瘪粒和未成熟的青粒，瘪粒及未成熟青粒发芽率很低或者不成苗，大田种植过程中自然淘汰。沉水底的种子透明度好，籽粒饱满。水选后悬浮的籽粒晾干留种备用，沉底种子弃用。
33.实施例2未经过水选与经过水选的f2代种子进行kasp分子标记检测基因分型
34.以
‘
优糖稻’为供体亲本，分别与
‘
s08-18’、
‘
sl-24’、
‘
沪稻89’的三个杂交组合分
别为f
1-1
，f
1-2
和f
1-3
，对sbe3-rs基因分型采用自主开发的sbe3-rs的kasp分子标记进行检测。
35.依据高抗性淀粉基因型sbe3-rs基因的snp突变信息位点信息，设计kasp引物，由两条上游引物(引物1、引物2)和一条下游引物(引物3)组成，两条上游引物的5’端分别连接有荧光标签序列，其中引物1的5’端连接fam荧光标签序列5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’，引物2的5’端连接为hex荧光标签序列：5
’‑
gaaggtcggagtcaacgg-3’。
36.所述引物的具体核苷酸如下：
37.引物1：5
’‑
tatgctgaaagtcatgatcaagcact-3’；
38.引物2：5
’‑
atgctgaaagtcatgatcaagcacc-3’；
39.引物3：5
’‑
caaccagaatgcaatagttttgtcaccaa-3’。
40.两条上游引物的3’末端等位变异碱基t/c，用于区分等位基因，1和3扩增读出野生型，2和3扩增读出突变型，如果是杂合型的，1，2都有可以与3扩增，下游引物的序列扩增在60-100bp。
41.具体的kasp分子标记检测方法如下：
42.1、样品准备：采用ctab法抽提叶片样品dna，水稻小量dna提取法，主要参考mccouch等(1988)的报道，方法简述如下：
43.1)剪取一小片叶片4-5cm，加入700μl 1.5
×
ctab(含1.5％ctab，75mm tris-hcl，15mm edta，1.05m nacl)，充分研磨；
44.2)将匀浆转入1.5ml的离心管，56℃水浴20min后冷却至室温；
45.3)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，摇匀；
46.4)最高速度(13200rpm)离心10min；
47.5)将上清液转入新的离心管，并加入两倍体积的预冷的100％酒精，静止20min后离心收集dna；
48.6)去上清，风干dna，加50-100μl双蒸水溶解，于紫外分光光度计中检测。
49.7)稀释dna，制备一套dna工作溶液，其浓度为50-100ng/μl左右，4℃冰箱保存备用，
50.2、kasp标记检测
51.pcr体系构建，每个反应15μl体系：2
×
kasp master mix 7.5μl，引物1-fam：0.25μl，引物2-hex：0.25μl，通用引物3：0.5μl，dna模板2μl，h2o：4.5μl。
52.pcr反应条件：第一步预变性94℃15min；第二步变性、复性、延伸，94℃20s、从61℃-55℃(每个循环下降0.6℃)60s，共10个循环；第三步变性、复性、延伸，94℃20s、55℃60s，共26个循环；第四步，反应结束后，酶标仪pherastar上进行读板。
53.采用snpviewer2软件对扫描数据进行分析，根据分析结果确定水稻样本的sbe3-rs基因型，分别对经过水选及未经过水选的3个杂交组合(f
1-1
、f
1-2
和f
1-3
)的f2群体的基因型进行分析，结果见表1。
54.表1 sbe3-rs基因kasp检测的基因分型结果
55.[0056][0057]
从表中可以看出，未经过水选的3个杂交组合的f2代种子发芽后检测发现，sbe3-rs基因纯合型的比率为7.69％-12.36％，平均仅为9.98％，而经过本发明水选的f2代的基因纯合型比率为54.65％-63.16％，平均约为58.65％，经过水选的纯合型比未经过水选的比例提高了4-8倍，可见，低世代获得纯合型比率大大提高，大大提高了高抗性淀粉水稻低世代抗性淀粉基因型纯合单株获得率。
[0058]
实施例3
[0059]
种植经实施例1水选中选的f2种子，选取综合农艺性状优良的单株，按单株收获，得f3种子；室内分单株脱糙米，筛选糙米垩白率70％以上的单株保留，无需分子标记检测，种植成小区，每个小区50-100株，在稻瘟病高发时期进行稻瘟病田间抗性鉴定，选择符合育种目标的综合农艺性状优良的株系，再从中选株系中选择优良单株，按照单株收获，得f4代种子；
[0060]
按照f4代种子的获得方式连续种植，直至获得f7代种子，选择标准同f4代的筛选标准，种植f7代种子后，在苗期进行sbe3-rs基因的kasp分子标记检测验证基因型，kasp检测方法参照实施例2，混合收获单株种子，同时测定抗性淀粉含量，即获得稳定的符合育种目标的高抗性淀粉改良品种，获得的高抗性淀粉水稻品种抗性淀粉含量大于10％。