提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法与流程

1
nacl溶液实现。
12.本发明还涉及抗盐复合溶液在提高南方红豆杉种苗盐胁迫能力方面的用途。
13.本发明具有以下有益效果：
14.本发明提供一种提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法，采用盆栽实验对南方红豆杉进行盐胁迫处理，模拟盐胁迫场景，通过喷施抗盐复合溶液，可以有效缓解南方红豆杉遭遇盐胁迫后对植物所造成的伤害，提高南方红豆杉种苗的盐胁迫能力。
15.本发明还证实向叶片喷施抗盐复合溶液，可增加植物体内sod、pod、cat活性，以此来提高南方红豆杉盐胁迫能力。
16.本发明提供的方法操作简单，安全可靠，效果显著，为盐碱地的植被恢复提供理论技术依据，为长江流域盐碱地的利用开发提供更多植物选择。
17.本发明提供的抗盐复合溶液中，氯化钙的ca
2+
作为植物中主要的第二信使，在细胞信号转导中起重要作用，能够激活并调节细胞内代谢系统的酶活性，帮助植物适应盐胁迫环境；三十烷醇是一种高效的广谱植物生长调节剂，可促进植物光合产物的积累，储存更多营养物质，便于植物消耗能量抵抗盐胁迫；硝酸钾中的k
+
能改变细胞的渗透式、减少植物蒸腾、调节水分平衡、调节气孔关闭，从而增强植物的抗逆性；通过向植物叶片表面喷施水杨酸，可以减少细胞膜发生膜脂过氧化，增加细胞膜的稳定性，上述成分组合使用，可以起到较好的缓解逆境胁迫的生理功能。
附图说明
18.图1为实施例1～3及对比例1-1中各处理下南方红豆杉种苗sod活性变化。
19.图2为实施例1～3及对比例1-1中各处理下南方红豆杉种苗pod活性变化。
20.图3为实施例1～3及对比例1-1中各处理下南方红豆杉种苗cat活性变化。
21.图4为实施例及对比例处理后第15d南方红豆杉种苗表型变化。
具体实施方式
22.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
23.1、实施例1：提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法
24.1)试验材料来源：2020年11月采集饱满的南方红豆杉种子，变温层积催芽处理后，于2021年3月播种于育苗穴盘中。2021年7月选择长势一致无病虫害的1年生南方红豆杉实生苗，于温室大棚中进行盆栽管理，每盆1株。盆栽基质体积比为泥炭∶珍珠岩＝2∶1。
25.2)盐胁迫设置：2021年8月开展试验。当盆栽基质干燥时，每盆浇灌100mmol
·
l-1
nacl溶液1l，保证浇透基质，为保证各处理的盐分浓度，在每个育苗容器下放置一个托盘，试验过程中及时将渗入托盘中的溶液倒回育苗基质中。
26.3)抗盐复合溶液配置：溶液各成分按以下重量计算比例配置：称取氯化钙10g，三十烷醇5g，硝酸钾6g，水杨酸1g。三十烷醇及水杨酸首先用适量乙醇加热进行溶解，最后用去离子水将以上成分定容到1000ml容量瓶中。
27.4)喷施：对南方红豆杉种苗叶片定量喷洒10ml抗盐复合溶液，喷施时间为每天上午8-10点，每24h喷洒一次,连续喷施5d。
28.5)采集记录：从处理开始采集叶片，每隔2d采集一次，共取样6次，检测各种酶类活性。第15d拍照记录植株长势表型情况。
29.实施例2：
30.参照实施案例1，其他处理条件不变，将第4)步骤的“定量喷洒10ml抗盐复合溶液”，设置为“定量喷洒15ml抗盐复合溶液，”、“定量喷洒20ml抗盐复合溶液，”进行试验，观测记录植株变化情况。
31.编号抗盐复合溶液喷施量成活长势叶片评价枝干评价实施例2-115ml未出现异常未出现异常未出现异常实施例2-220ml未出现异常未出现异常未出现异常
32.实施例3：
33.参照实施案例1，其他处理条件不变，将第3)步骤的“称取氯化钙10g，三十烷醇5g，硝酸钾6g，水杨酸1g。”分别设置为“称取氯化钙6g，三十烷醇7g，硝酸钾7g，水杨酸1g。”、“称取氯化钙8g，三十烷醇3g，硝酸钾8g，水杨酸1g。”、“称取氯化钙12g，三十烷醇4g，硝酸钾7g，水杨酸1g。”进行试验，观测记录植株变化情况。
[0034][0035]
对比例1：
[0036]
参照实施案例1，其他处理条件不变，将第3)步骤的“抗盐复合溶液”分别设置为“去离子水”、“质量分数为1％的氯化钙溶液”、“质量分数为0.1％的水杨酸溶液”进行对比试验，观测记录植株变化情况。
[0037][0038]
对比例2：
[0039]
参照实施案例1，其他处理条件不变，将第4)步骤的“喷施时间为每天上午8-10点”，设置为“喷施时间为每天中午12-14点”、“每天下午18-20点”进行对比试验，观测记录植株变化情况。
[0040][0041][0042]
对比例3：
[0043]
参照实施案例1，其他处理条件不变，将第4)步骤的“定量喷洒10ml抗盐复合溶液”，设置为“定量喷洒5ml抗盐复合溶液，”、“定量喷洒25ml抗盐复合溶液，”进行试验，观测记录植株变化情况。
[0044][0045]
2、生理指标测定
[0046]
1)sod酶的测定
[0047]
将样本用液氮磨成粉末后，称取约0.2g试样，加入2ml pbs溶液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测；取10μl上清液，加入160μl1mg/mlwst-8、20μl1mmol/l二乙基二硫代氨基甲酸钠、10μl 0.01mg/ml sod酶，充分混匀，室温静置30min后，450nm处测定各管吸光值。对照管用蒸馏水替换上清液，其他条件不变。
[0048]
2)pod酶的测定
[0049]
将样本用液氮磨成粉末后，称取约0.2g试样，加入2ml pbs液体进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测；取5μl上清液，加入120μl 100mmol/l磷酸缓冲液溶液、30μl愈创木酚、30μl 30％过氧化氢以及60μl蒸馏水。立即混匀并计时，立即取200μl转移至96孔板中，记录470nm下30s时的吸光值a1和90s后的吸光值a2。计算δa＝a2-a1。
[0050]
3)cat酶的测定
[0051]
将样本用液氮磨成粉末后，称取约0.2g试样，加入2ml pbs液体进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测；在96孔板中加入10μl样本和190μl30％h2o2，立即混匀并计时，记录240nm下0s吸光值a1和60s时的吸光值a2。计算δa＝a1-a2。
[0052]
4)数据处理
[0053]
采用excel 2016整理计算数据和绘图，采用三次重复取样的平均值作为实测值进行绘图，采用spss 20.0进行统计分析。
[0054]
3、结果分析
[0055]
1)南方红豆杉幼苗表型变化
[0056]
南方红豆杉幼苗在遭遇盐胁迫的第4d时，对比例的南方红豆杉幼苗呈现出不同程度的叶片萎蔫等盐害症状；第8d时，对比例开始出现叶片异常现象，尤其是对比例1-1的叶
片出现严重卷曲萎蔫，部分叶片开始凋落；第15d时，部分对比例的叶片尖端呈现黄化焦枯的症状，对比例1-1植株已经死亡，叶片最终完全脱落，茎干枝条已经出现干枯褐色，见图4。实施例的南方红豆杉长势一直未出现异常，并未表现出可见的盐害症状。
[0057]
2)sod活性变化
[0058]
sod是重要的自由基清除剂之一，是抵御活性氧伤害的“第一道防线”，是防护氧自由基对细胞膜系统伤害的保护酶，它的活性与植物抗氧化能力成正相关性，是植物抗逆性的重要标志。当植物受到盐胁迫产生有害的超氧自由基时，sod可发挥作用将其清除，保证植物的代谢平衡。但当盐胁迫过大时，植物体内代谢紊乱，sod活性随之下降。
[0059]
外源喷施适量抗盐复合溶液能够显著提升sod活性，实施例的南方红豆杉幼苗叶片sod活性始终高于喷施等量去离子水的对比例1-1，促进了盐胁迫下保护酶活性的上调，且均达到了显著水平，表明幼苗本身清除活性氧的能力得到显著提升。
[0060]
由图1可知，在盐胁迫下，南方红豆杉幼苗的叶片sod活性呈现出先升高后下降的趋势，外源喷施适量抗盐复合
+
溶液能将sod活性维持在较高的水平，延缓sod活性的下降。
[0061]
3)pod活性变化
[0062]
pod是植物体内的一种保护酶类，是与衰老有关的一种酶，可以清除细胞体产生较少的o
2-，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它的活性与植物的抗逆能力密切相关。
[0063]
外源喷施适量抗盐复合溶液能够显著提升pod活性，将pod活性维持在较高的水平，延缓pod活性的下降。由图2可知，盐胁迫可导致南方红豆杉幼苗叶片pod活性呈现出先上升后下降的趋势，随着盐胁迫时间的推进，喷施适量抗盐复合溶液可保证pod活性始终高于喷施等量去离子水的对比例1-1，且维持在相对稳定的水平，促进了盐胁迫下保护酶活性的上调，幼苗本身清除活性氧的能力得到显著提升，pod活性相比对比例1-1均达到了显著水平。
[0064]
外源喷施适量抗盐复合溶液能有效提升盐胁迫下pod活性的增长速率。对比例1-1在遭遇盐胁迫时，pod活性增长速率较缓慢，而喷施适量抗盐复合溶液的实施例，增长速率显著提升。
[0065]
4)cat活性变化
[0066]
cat作为植物体内的一种保护酶，在植物遭遇胁迫时，可以协助sod清除自由基所产生的高浓度h
202
，将活性氧控制在植物可承受的范围内，减弱膜脂过氧化作用对细胞膜的伤害。
[0067]
外源喷施适量抗盐复合溶液能够显著提升cat活性，将cat活性维持在较高且相对稳定的水平，保证cat活性始终高于喷施等量去离子水的对比例1-1，并且均达到显著水平。由图3可知，盐胁迫可导致南方红豆杉幼苗叶片cat活性呈现出先上升后下降的趋势，随着盐胁迫时间的推进，喷施适量抗盐复合溶液可提升cat活性增长速率，同时还可减缓cat活性的下降速率，促进盐胁迫下保护酶活性的上调，幼苗本身清除活性氧的能力得到显著提升。
[0068]
综上所述，结合南方红豆杉表型和相关抗氧化酶的活性综合判定，结果显示，通过向南方红豆杉叶片喷施特制的抗盐复合溶液，可显著提高植物体内sod、pod、cat活性，有效缓解南方红豆杉遭遇盐胁迫后对植物所造成的伤害，提高南方红豆杉抗击盐胁迫的能力。
[0069]
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本技术中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。