一种细胞冻存液及其制备方法与流程

1.本发明涉及细胞冻存液制备技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法。


背景技术：

2.目前，细胞药物已经在临床肿瘤治疗过程中取得了良好的效果。细胞制剂的主要成分为活细胞和细胞溶剂，活细胞的保存时间相对有限，一般不超过24h；在细胞制剂的安全性和有效性检测结果还未获得时，只能通过中间品检测结果和快速放行结果进行放行，存在一定风险。冻存是细胞长期保存并等待检测放行的重要手段，可以通过细胞冻存后等待细胞制剂检测结果合格后再进入临床使用，从而提高临床用细胞的安全性。
3.但是，现有的细胞冻存液使用前大多需要0℃以下的低温冻存；使用时，需要将冻存液放置在2～8℃条件下进行解冻，然后才能使用，操作较繁琐。现有技术中虽然有可以在2～8℃保存的细胞冻存液，但是随着保存时间增加，如保存半年或者一年后使用，其对细胞复苏后的细胞活率大打折扣。因此，提供一种能在2～8℃保存一年，并且能使冻存复苏后的细胞具有较高细胞活率的细胞冻存液具有重要的应用前景。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种细胞冻存液。
5.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
6.一种细胞冻存液，其包含无机盐水溶液、dmso、聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉。
7.本发明经大量的实验研究表明，采用由无机盐水溶液、dmso、聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉组成的细胞冻存液，其可以实现在0℃以上保存，并且在冻存细胞时具有一定的细胞复苏后细胞活率。
8.优选地，dmso与无机盐水溶液的体积用量比为1～5:99～95。
9.最优选地，dmso与无机盐水溶液的体积用量比为5:95。
10.优选地，每100ml细胞冻存液中，聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉的含量分别为：
11.聚乙烯醇0.5～5g；聚乙二醇1～10g，维生素1～3g以及羟乙基淀粉1～5g。
12.优选地，每100ml细胞冻存液中，聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉的含量分别为：
13.聚乙烯醇1～3g；聚乙二醇2～5g，维生素1～2g以及羟乙基淀粉2～3g；
14.最优选地，每100ml细胞冻存液中，聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉的含量分别为：
15.聚乙烯醇2g；聚乙二醇5g，维生素2g以及羟乙基淀粉3g。
16.优选地，所述的聚乙二醇选自聚乙二醇400；所述的维生素选自维生素e。
17.优选地，所述的无机盐水溶液为质量分数为0.5～1％的氯化钠水溶液。
18.优选地，细胞冻存液中还包含植物提取物。
19.进一步优选地，所述的植物提取物为葡萄籽提取物。
20.发明人在研究中发现，由无机盐水溶液、dmso、聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉组成的细胞冻存液，虽然可以实现在2-8℃保存，但是随着保存时间的延长，尤其是在2～8℃保存1年后再使用，对冻存在其中的细胞复苏后的细胞活率较低。
21.为了进一步解决该问题，发明人在研究中惊奇的发现，在本发明所述组成的细胞冻存液中加入葡萄籽提取物，可以有效地提高在2～8℃保存1年后的细胞冻存液的细胞复苏后的细胞活率。
22.进一步优选地，所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：
23.取葡萄籽，然后加入8～12倍重量的乙酸乙酯进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物。
24.发明人在研究中发现，葡萄籽提取物的提取溶剂的选择对于制备得到的葡萄籽提取物加入到细胞冻存液中，能否大幅提高细胞复苏后的细胞活率起着决定性作用。发明人在研究中惊奇的发现，在本发明所述的细胞冻存液中加入采用乙酸乙酯提取得到的葡萄籽提取物，其对细胞复苏后的细胞活率的提高程度远远高于加入采用其它溶剂提取得到的葡萄籽提取物。
25.优选地，所述的植物提取物由葡萄籽提取物和芦荟提取物混合而成；
26.其中，葡萄籽提取物和芦荟提取物的用量比为1～3:1。
27.最优选地，葡萄籽提取物和芦荟提取物的用量比为2:1。
28.所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：取新鲜的芦荟，然后加入8～12倍重量的体积分数为50％～60％的甲醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的芦荟提取物。
29.发明人进一步研究发现，将葡萄籽提取物和芦荟提取物组合后加入到本发明所述的细胞冻存液中，其可以进一步大幅提高细胞复苏后的细胞活率；研究表明，加入了葡萄籽提取物和芦荟提取物的细胞冻存液，在2～8℃保存1年后再使用，对冻存在其中的细胞的具有十分优异的细胞复苏后的细胞活率，其细胞活率可以达到95％以上。
30.发明人在此需要强调的是，葡萄籽提取物和芦荟提取物的提取物溶剂的选择十分关键；发明人在大量的实验中研究表明；只有采用乙酸乙酯提取得到的葡萄籽提取物与采用体积分数为50％～60％的甲醇提取得到的芦荟提取物组合后，加入到本发明的冻存液中，才可以大幅提高细胞复苏后的细胞活率；而采用其它溶剂提取得到的葡萄籽提取物以及芦荟提取物组合后加入到本发明的冻存液中，并不能大幅提高细胞复苏后的细胞活率。
31.优选地，每100ml细胞冻存液中，植物提取物的含量为1～3g。
32.最优选地，每100ml细胞冻存液中，植物提取物的含量为2g。
33.优选地，所述的细胞为外周血单个核细胞。
34.本发明还提供了一种细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
35.将dmso、聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉加入到无机盐水溶液中混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；或，
36.将dmso、聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素、羟乙基淀粉以及植物提取物加入到无机盐
水溶液中混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液。
37.有益效果：本发明提供了一种全新组成的细胞冻存液；本发明所述的细胞冻存液可以实现在2～8℃保存，并且在冻存细胞时具有优异的细胞复苏后的细胞活率。尤其是加入了由本发明所述方法制备得到的葡萄籽提取物和芦荟提取物的细胞冻存液，在2～8℃保存1年后再使用，其对冻存在其中的细胞具有优异的细胞复苏后的细胞活率。
38.由于本发明所述的细胞冻存液能在2～8℃保存；因此，在使用时不需要将细胞冻存液提前解冻，能够实现即取即用，大大提高了操作的便利性。
具体实施方式
39.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
40.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
41.实施例1细胞冻存液的制备
42.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e以及3g羟乙基淀粉混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液。
43.实施例2细胞冻存液的制备
44.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e、3g羟乙基淀粉以及2g植物提取物混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；
45.所述的植物提取物为葡萄籽提取物，所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：取葡萄籽，然后加入10倍重量的乙酸乙酯进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物。
46.实施例3细胞冻存液的制备
47.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e、3g羟乙基淀粉以及2g植物提取物混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；
48.所述的植物提取物由葡萄籽提取物和芦荟提取物混合而成；
49.所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：取葡萄籽，然后加入10倍重量的乙酸乙酯进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物；
50.所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：取新鲜的芦荟，然后加入10倍重量的体积分数为55％的甲醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的芦荟提取物。
51.实施例4细胞冻存液的制备
52.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e、3g羟乙基淀粉以及2g植物
提取物混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；
53.所述的植物提取物为葡萄籽提取物，所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：取葡萄籽，然后加入10倍重量的甲醇进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物。
54.实施例4与实施例2的区别在于，提取溶剂不同；实施例4采用的是甲醇提取葡萄籽；而实施例2则是采用乙酸乙酯提取葡萄籽。
55.实施例5细胞冻存液的制备
56.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e、3g羟乙基淀粉以及2g植物提取物混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；
57.所述的植物提取物为葡萄籽提取物，所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：取葡萄籽，然后加入10倍重量的体积分数为95％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物。
58.实施例5与实施例2的区别在于，提取溶剂不同；实施例5采用的是体积分数为95％的乙醇水溶液提取葡萄籽；而实施例2则是采用乙酸乙酯提取葡萄籽。
59.对比例1细胞冻存液的制备
60.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e、3g羟乙基淀粉以及2g植物提取物混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；
61.所述的植物提取物由葡萄籽提取物和芦荟提取物混合而成；
62.所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：取葡萄籽，然后加入10倍重量的甲醇进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物；
63.所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：取新鲜的芦荟，然后加入10倍重量的甲醇进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的芦荟提取物。
64.对比例2细胞冻存液的制备
65.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e、3g羟乙基淀粉以及2g植物提取物混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；
66.所述的植物提取物由葡萄籽提取物和芦荟提取物混合而成；
67.所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：取葡萄籽，然后加入10倍重量的体积分数为95％的乙醇水溶液进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物；
68.所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：取新鲜的芦荟，然后加入10倍重量的乙酸乙酯进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的芦荟提取物。
69.对比例3细胞冻存液的制备
70.首先将5ml的dmso加入到95ml的无机盐水溶液(质量分数为0.9％的氯化钠水溶液)中，然后再依次加入2g聚乙烯醇、5g聚乙二醇400、2g维生素e、3g羟乙基淀粉以及2g植物提取物混合，待各组分溶解变为透明粘稠的均匀溶液后即得所述的细胞冻存液；
71.所述的植物提取物由葡萄籽提取物和芦荟提取物混合而成；
72.所述的葡萄籽提取物通过如下方法制备得到：取葡萄籽，然后加入10倍重量的乙酸乙酯进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的葡萄籽提取物；
73.所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：取新鲜的芦荟，然后加入10倍重量的乙酸乙酯进行加热回流提取，提取结束后将提取液浓缩干燥后即得所述的芦荟提取物。
74.实验例
75.(1)将按照实施例1～5以及对比例1～3制备得到的细胞冻存液，在4℃条件下保存1年。
76.(2)分别取1.5ml保存1年后的按照实施例1～5以及对比例1～3制备得到的细胞冻存液，重悬从外周血分离得到的外周血单个核细胞，轻吹混匀制成单细胞悬液；接着将冻存管放入程序降温盒中，置于-80℃冰箱过夜或-80℃冰箱放置12h；后将通过程序降温的细胞转入液氮罐中置于液氮液面下冻存1个月；
77.(3)取出液氮冻存1个月的外周血单个核细胞，在37℃水浴中复苏，复苏后在细胞培养基中重悬细胞，轻吹混匀制成单细胞悬液，取样进行细胞计数和细胞活性检测；计算细胞复苏后的细胞活率；结果见表1。
78.表1.本发明细胞冻存液对于细胞复苏后细胞活率的影响
[0079][0080][0081]
由表1中的实验数据可以看出：
[0082]
实施例1制备得到的细胞冻存液，在4℃下保存1年后取出使用；其细胞复苏后的细胞活率仍然有61％；这说明本发明由无机盐水溶液、dmso、聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉组成的细胞冻存液，其在4℃下保存1年后使用，仍然具有一定的细胞活率。
[0083]
实施例2制备得到的细胞冻存液，在4℃下保存1年后取出使用；对于冻存其中的细胞复苏后的细胞活率达到了83％；与实施例1相比，得到了显著的提高；这说明：在本发明所述组成的细胞冻存液中加入葡萄籽提取物可以有效地提高细胞复苏后的细胞活率。
[0084]
实施例4和5制备得到的细胞冻存液，在4℃下保存1年后取出使用；对于冻存其中的细胞复苏后的细胞活率分别为68％和65％，与实施例1先比，提高的并不明显，其提高程度远远小于实施例2；这说明：葡萄籽提取物的提取溶剂的选择对于制备得到的葡萄籽提取物加入到细胞冻存液中，能否大幅提高细胞冻存液对于细胞复苏后的细胞活率起着决定性
作用；在本发明所述的细胞冻存液中加入采用乙酸乙酯提取得到的葡萄籽提取物，其对细胞复苏后的细胞活率提高程度远远高于加入采用其它溶剂提取得到的葡萄籽提取物。
[0085]
实施例3制备得到的细胞冻存液，在4℃下保存1年后取出使用；对于冻存其中的细胞复苏后的细胞活率高达97％；进一步高于实施例2以及远远高于实施例1；具有十分优异的细胞活率；这说明：将葡萄籽提取物和芦荟提取物组合后加入到本发明所述的细胞冻存液中，其可以进一步大幅提高细胞复苏后的细胞活率。
[0086]
对比例1～3制备得到的细胞冻存液，在4℃下保存1年后取出使用；对于冻存其中的细胞复苏后的细胞活率远远小于实施例3，同时还不及实施例2；这说明：葡萄籽提取物和芦荟提取物的提取物溶剂的选择十分关键；只有采用乙酸乙酯提取得到的葡萄籽提取物与采用体积分数为50％～60％的甲醇提取得到的芦荟提取物组合后，加入到本发明的冻存液中，才可以大幅提高细胞复苏后的细胞活率，才能达到95％以上的细胞活率；而采用其它溶剂提取得到的葡萄籽提取物以及芦荟提取物组合后加入到本发明的冻存液中，并不能大幅提高细胞复苏后的细胞活率。