一种测定消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的方法

1.本发明属于水治理领域，具体涉及一种测定消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的方法。


背景技术：

2.抗生素的发现挽救了无数人的生命，并成为人类健康的重要保障，被广泛应用于医疗、畜牧业和养殖业等行业中。但与此同时，抗生素的大量使用使得其在环境中残留过多，在这种选择性压力下，能够对抗生素产生耐药性的基因突变被保留下来，这种基因被称为抗性基因；这些含有抗性基因的细菌被称为耐药细菌，其在抗生素存在的情况下称为优势菌种，抗性基因也得以遗传延续。抗生素的滥用极大地加剧了细菌耐药性的产生，而耐药细菌和抗性基因也在2006年作为环境中一种新型污染物被提出，并在世界范围内引起了高度重视。
3.细菌耐药性可由染色体或质粒介导，它们编码不同的蛋白，通过多种生物化学机制使细菌抵御抗生素或直接杀灭抗生素。常见的耐药机制有产生抗素灭活酶、抗生作用靶位改变、细胞壁或膜通透性改变和药物主动外排泵以及改变对代谢物循环需求等途径等。自然环境中多种抗生素的积累，使得细菌因为选择性压力而通过上述多种方式产生耐药性。
4.作为多种含抗生素和细菌的废水的汇集地，目前也在污水处理厂也检出了多种类型的耐药细菌和抗性基因。在各种常用污水处理工艺中，消毒工艺是降低污水处理生物(尤其是病原菌)后续传播风险、保障水质安全的有效手段。
5.同时，在新冠肺炎大流行期间，消毒剂、酒精洗手液和杀菌洗手液的使用激增；作为预防措施，废水消毒中使用的氯消毒剂的剂量也有所提升。过度的氯消毒剂的使用会引起水中消毒副产物浓度的增加。有研究表明，消毒副产物同样具有毒性，对会增强细菌对抗生素的耐药性，增加转化转移频率，表明水环境中消毒副产物的存在增加了耐药污染对人类健康的影响。但现阶段关于消毒副产物对耐药细菌接合转移的影响研究较少。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种测定消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的方法。
7.本发明提供了一种消毒副产物的新用途，在研究过程中发明了一种测定消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的方法。消毒工艺是污水处理的常用手段，近年来，消毒剂、酒精洗手液和杀菌洗手液的使用激增，废水消毒中使用的氯消毒剂的剂量也有所提升。部分消毒副产物，包括氯消毒剂具有一定毒性，例如一氯乙腈就是一种有毒的有机物。但是本发明的研究表明，微量的一氯乙腈毒性甚微，而且还有一定的抑菌作用，包括抑制细菌的接合转移能力，尤其是对于部分耐药细菌有较好的抑制作用。本发明的方法也涉及一种测定消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的方法，该方法可以作为一种标准测试方法，
适用于其他消毒副产物，用于快速了解消毒副产物对细菌的接合转移能力的改变情况。
8.本发明所述的消毒副产物的用途是一氯乙腈在制备抑制细菌的药物中的应用。优选地，所述的抑制细菌的药物选自但不限于：
9.抑制细菌的接合转移活性；
10.抑制耐药细菌的数量或者活力；
11.抑制耐药细菌的接合转移活性。
12.优选地，所述的消毒副产物含有一氯乙腈。所述的抑制细菌的药物或者消毒副产物中一氯乙腈使用的终浓度不高于1000μg/l，例如浓度为10-100μg/l，或者100μg/l-1000μg/l。
13.优选地，所述的细菌是大肠杆菌，所述的细菌包括但不限于具有卡纳霉素耐性和/或利福平耐性的大肠杆菌，受体通常使用含有受体特征质粒，更优地，可以在受体质粒上插入含有易检测指标的元件，例如gfp蛋白编码基因等。在本发明的一个优选实施例中，所述细菌是使用含有卡纳霉素的lb琼脂平板筛选的大肠杆菌hb101(rp4)或者使用含有利福平的大肠杆菌nk5449。供体菌(即供体细菌)和/或受体菌(即受体细菌)的浓度在10
4-10
10
cfu/ml，优选地，供体菌和/或受体菌的浓度是10
5-109cfu/ml，10
6-108cfu/ml，10
5-108cfu/ml，等。
14.优选地，所述的用途可以是使用消毒副产物抑制耐药细菌接合转移能力。所述的用途可以包括以下步骤：
15.s1,获取对抗生素耐药的菌株并且活化；
16.s2,分别取受体菌和供体菌，在含有消毒副产物的培养基中孵育受体菌和/或供体菌,培养过夜；
17.s3,获得接合转移能力下降的接合子细菌。
18.本发明还提供了一种抑制耐药细菌接合转移能力的方法，所述的方法包括以下步骤：
19.(1)获取备用的受体菌和供体菌，使获得对抗生素的耐药性；或者获取对抗生素耐药的菌株并且活化；
20.(2)分别取受体菌和供体菌，在含有消毒副产物的培养基中混合受体菌和供体菌；
21.(3)过夜培养；
22.(4)获得接合转移能力下降的接合子细菌。
23.优选地，用于接合的受体菌和/或供体菌处于对数生长期。
24.具体地，所述的方法包括以下步骤：
25.将于-80℃冰箱保存的大肠杆菌hb101或者大肠杆菌nk5449的甘油管置于常温下融化后，分别用移液枪吸取100μl菌液加入到50mg/l卡纳霉素的lb液体培养基、含160mg/l利福平的lb液体培养基中；于37℃，150rpm条件下在恒温摇床中过夜培养16小时；
26.所述的大肠杆菌hb101携带rp4质粒，对卡纳霉素、四环素、氨苄青霉素耐药；
27.所述的大肠杆菌nk5449对利福平耐药。
28.取过夜培养后的上述两种大肠杆菌菌液各0.1ml，加入含各自对应抗生素的50ml lb液体培养基中，于37℃，150rpm条件下在恒温摇床中培养4h至对数期。取两种耐药细菌菌液各10ml，分别进行4000rpm离心，弃掉上清液，并用灭菌生理盐水溶液冲洗，洗去残留的培
养基和抗生素；最后用等体积生理盐水溶液重悬浮。
29.具体地，所述接合转移是指：取上述大肠杆菌hb101菌悬液1ml、大肠杆菌nk5449菌悬液2ml，加入50ml不含抗生素并且含有一氯乙腈的lb液体培养基中，置于37℃、150rpm的摇床中过夜培养15-18小时。
30.为了能够准确、快捷的衡量消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响，本发明还提供一种测定消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的方法，包括以下步骤：
31.使用消毒副产物与耐药细菌和接合转移处理的接合子分别孵育；
32.取含有接合转移处理的接合子的菌液平板计数，以使用消毒副产物孵育的供体细菌为对照；
33.接合转移频率计算方式如下：
[0034][0035]
优选地，本发明的方法还包括以下步骤：
[0036]
取接合转移处理的菌液过夜培养后，进行重悬浮、梯度稀释后取若干梯度已备平板计数；
[0037]
所述的消毒副产物含有一氯乙腈，优选地，一氯乙腈的终浓度不大于2000μg/l；更优地，一氯乙腈的终浓度不大于1000μg/l。
[0038]
可以用于受体菌和/或供体菌的细菌视待测指标而定。例如，检测接合转移能力的受体通常细胞膜容易穿透，供体菌含有待转移的特性载体，例如质粒，而且优选含有容易检测元件，例如gfp或者双荧光素酶系统。为了操作方便，优选使用具有受体或者供体特性的大肠杆菌。供体菌和受体菌的使用比例可以为1:1-1:10，例如1:2-1:7，1:1-1:5，等。所述的比例是细菌克隆数、菌落形成数量的比例或者是细菌数量的比例。
[0039]
更优地，受体菌和供体菌可以配对使用。在本发明的一个优选例中，供体菌和受体菌分别是大肠杆菌hb101(rp4)和大肠杆菌nk5449。供体菌和/或受体菌的浓度在10
4-10
10
cfu/ml，优选地，供体菌和/或受体菌的浓度是10
5-109cfu/ml，10
6-108cfu/ml，10
5-108cfu/ml，等。
[0040]
优选地，平板计数时，使用含50mg/l卡纳霉素的lb琼脂平板筛选供体菌大肠杆菌hb101，使用含160mg/l利福平的lb琼脂平板筛选受体菌大肠杆菌nk5449，用同时含有50mg/l卡纳霉素和160mg/l利福平的lb琼脂平板筛选接合子。
[0041]
优选地，用于接合的受体菌和/或供体菌过夜培养的时间为6小时以上，优选地，所述的过夜培养的时间是6-24小时，更优地，适合本发明中受体菌和/或供体菌的过夜培养时间是12-20小时，例如12小时、15小时、16小时、18小时、20小时，等等。
[0042]
接合转移处理过程中使用的培养基应当事先经过灭菌，并且在培养受体、供体、接合子时有足够支持菌体生长的营养，例如含有足量的碳、氮、磷和糖。
[0043]
本发明的方法能够用于了解待测消毒副产物对细菌、尤其是耐药细菌的接合转移能力的影响，包括定性和定量的判断，从而根据已经了解的水体中细菌情况，控制消毒剂的使用以及消毒副产物的种类和浓度。
[0044]
本发明还涉及相应的评估消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的试剂盒。所述的试剂盒中包含接合转移处理使用试剂和接合转移频率计算对照表。
[0045]
优选地，所述的接合转移处理使用试剂包括但不限于：消毒副的稀释剂、大肠杆菌hb101(rp4)、大肠杆菌nk5449、lb液体培养基、灭菌生理盐水、卡纳霉素、利福平、lb琼脂平板中的一种或者几种。消毒副的稀释剂可以选用纯净水、蒸馏水、生理盐水等常见的无毒无害乃至食品级的溶剂。
[0046]
本发明中，mcan是指一氯乙腈，又称为氯乙腈(chloroacetonitrile)，cas:107-14-2，化学式:c2h2cln。为无色透明发烟液体，有刺激性呛味，可溶于乙醇和乙醚。主要用作分析试剂、熏蒸剂、杀虫剂、溶剂、有机合成中间体。
[0047]
卡纳霉素的英文别名有kanamycina；kanamycinbase；kanamycinmonosulfate；4,6-diamino-2-hydroxy-1,3-cyclohexane3,6’diamino-3,6'-dideoxydi-alpha-d-gluc；4,6-diamino-2-hydroxy-1,3-cyclohexane3,6’diamino-3,6
’‑
dideoxydi-alpha-d-glucos；d-deoxydi；d-streptamine,o-3-amino-3-deoxy-alpha-d-glucopyranosyl-(1.fwdarw.6)-o-[6-amin等。分子式：c
18h38
n4o
15
s，分子量：582.58，cas no.：133-92-6。卡纳霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30s核糖体结合从而致使mrna密码误读。若细菌中产生一种破坏卡纳霉素的酶，则可变为抗性株。卡纳霉素抗性的质粒经常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。
[0048]
利福平又译为利发霉素、甲哌利福霉素、甲哌力复霉素、威福仙、仙道伦、力复平或利米定，英文别名有rifobac；rifagen；rifadin；rifamycin amp；rifampicin；rimactane rifampin；rfp。利福平化学结构式cas号：13292-46-1，是一种所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用，对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有疗效。为红色或暗红色的结晶状粉末，不溶于水。一般为胶囊或者片剂口服药，与其他抗结核药合用起协同作用，并延缓耐药菌株产生。主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染，外用可治疗沙眼等。
[0049]
细菌获取抗性基因可通过两种途径，即自身基因突变和通过水平转移的方式从外界获得抗性基因。由于基因突变是一种自发性随机事件，突变率机率小，且不稳定，因此突变造成的耐药细菌在自然界中数量较少。细菌通过外界获得抗性基因的途径为：在外环境诱导下，经可移动遗传因子，如质粒、转座子、整合子、唾菌体等通过水平转移的方式传递而获得。水平转移是与纵向遗传由亲代传给子代耐药基因转移(又称垂直转移)过程相对的概念。迄今为止，在细菌间发生基因水平转移的主要方式有三种，分别为转化转移、转导转移和接合转移。
[0050]
(1)转化转移是指细菌从环境中直接摄取游离状态的抗性基因；因为即使在细菌死亡后，dna仍保持相对稳定，可以长期存在于环境中，故环境中存在大量游离dna；同样，一些受体细菌可以通过体内的调节系统获得在环境中自由摄入游离dna且完成dna表达，这使得转化转移在自然环境中的发生成为可能。转化转移的发生必须满足游离的dna片段足够多、且受体菌细胞膜呈现感受态两个条件。
[0051]
(2)转导转移是基因借助噬菌体等病毒载体进行转移；在转导转移过程中，噬菌体感染供体细菌，使得供体细菌的dna可能与噬菌体的遗传物质结合。供体细菌溶解后，噬菌体携带供体细菌的抗性基因继续感染下一个细菌，使得供体细菌中的耐药细菌可转移至受体细菌中。
[0052]
(3)接合转移是通过细胞与细胞接触，借助供体菌中携带有抗性基因及调控转移
相关基因的质粒或者转座子等载体发生转移的过程。在供体菌和受体菌的接触趋于稳定后，两种细菌通过管状菌毛结构建立起连接通道，复制后的质粒或转座子等载体随着通道从供体菌进入受体菌中，受体菌中存在可表达的抗性细菌，成为耐药细菌。接合转移是自然界中基因水平转移最常见、最有效的方式，对细菌耐药性的获得与进化具有重要作用。
[0053]
抗性基因的水平转移加速了抗性基因在环境中的快速传播，也促进了多重耐药菌的形成，是细菌耐药性发展与传播的重要途径，因此，如何控制耐药基因的水平转移，特别是接合转移，是现阶段值得关注的重点问题。
[0054]
本发明涉及水治理领域，具体涉及一种测定消毒副产物对耐药细菌接合转移能力影响的方法；将消毒副产物加入lb液体培养皿中，控制其因素(如温度、接合时间、供受体菌比例等)保持不变，通过测定供体菌、受体菌、接合子数量，计算接合转移频率；并与空白组接合转移频率进行对比，可得出消毒副产物的存在对耐药细菌接合转移能力的影响。
附图说明
[0055]
为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的每一幅附图针对本技术的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0056]
图1是环境中存在10μg/l mcan时耐药细菌接合转移能力的变化。
[0057]
图2是环境中存在100μg/l mcan时耐药细菌接合转移能力的变化。
[0058]
图3是环境中存在1000μg/l mcan时耐药细菌接合转移能力的变化。
[0059]
图4是不同浓度的一氯乙腈对受体菌浓度的影响比较图。
[0060]
图5是使用不同浓度的mcan对耐药细菌浓度的影响。
具体实施方式
[0061]
下面将通过本技术的实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分优选实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动所获得的所有其他实施例，都属于本技术的保护范围。
[0062]
实施例1
[0063]
选择mcan作为消毒副产物代表，选择大肠杆菌hb101(rp4)、大肠杆菌nk5449作为接合转移所需的供体菌、受体菌。mcan购自上海麦克林生化科技有限公司，纯度98％。
[0064]
(1)供体菌、受体菌准备
[0065]
将于-80℃冰箱保存的大肠杆菌hb101(携带rp4质粒，对卡纳霉素、四环素、氨苄青霉素耐药)、大肠杆菌nk5449(对利福平耐药)的甘油管置于常温下融化后，分别用移液枪吸取100μl菌液加入到50mg/l卡纳霉素的lb液体培养基、含160mg/l利福平的lb液体培养基中；于37℃，150rpm条件下在恒温摇床中过夜培养16h左右。
[0066]
取过夜培养后的上述两种大肠杆菌菌液各0.1ml，加入含各自对应抗生素的50ml lb液体培养基中，于37℃，150rpm条件下在恒温摇床中培养4h至对数期。取两种耐药细菌菌液各10ml，分别进行4000rpm离心，弃掉上清液，并用灭菌生理盐水溶液冲洗，洗去残留的培养基和抗生素；最后用等体积生理盐水溶液重悬浮。
[0067]
(2)接合转移
[0068]
取上述大肠杆菌hb101菌悬液1ml、大肠杆菌nk5449菌悬液2ml，加入50ml不含抗生素的lb液体培养基中(培养基中含有一氯乙腈mcan)，置于37℃、150rpm的摇床中过夜培养16h左右。从而获得经过一氯乙腈作用下接合转移的菌液。
[0069]
实施例2
[0070]
取接合转移处理的菌液过夜培养后，进行重悬浮、梯度稀释后取若干梯度已备平板计数。平板计数时，使用含50mg/l卡纳霉素的lb琼脂平板计算菌大肠杆菌hb101(rp4)的菌群数，使用含160mg/l利福平的lb琼脂平板计算菌大肠杆菌nk5449，以未经过mcan处理的大肠杆菌hb101(rp4)和大肠杆菌nk5449作为对照。
[0071]
结果显示，小于1000μg/l浓度的一氯乙腈对于受体和供体菌的存活影响不大。对含50mg/l卡纳霉素的lb琼脂平板上大肠杆菌hb101(rp4)和含160mg/l利福平的lb琼脂平板上大肠杆菌nk5449的存活率，mcan的影响并不显著(表1)。例如，mcan对大肠杆菌hb101存活率的影响：在添加0μg/l，10μg/l，100μg/l，1000μg/l mcan并过夜培养的情况下，各类菌液的od600值处于同一水平，mcan对大肠杆菌hb101的最终生长情况没有显著影响(图4)。
[0072]
实施例3
[0073]
取接合转移处理的菌液过夜培养后，进行重悬浮、梯度稀释后取若干梯度已备平板计数。平板计数时，使用含50mg/l卡纳霉素的lb琼脂平板筛选供体菌大肠杆菌hb101(rp4)，使用含160mg/l利福平的lb琼脂平板筛选受体菌大肠杆菌nk5449，用同时含有50mg/l卡纳霉素和160mg/l利福平的lb琼脂平板筛选接合子。
[0074]
接合转移频率计算方式如下：
[0075][0076]
在不同浓度下，mcan对大肠杆菌hb101(rp4)的接合转移频率的影响如表1所示。
[0077]
表1 mcan对大肠杆菌hb101和nk5449接合转移频率的影响
[0078][0079]
可见，mcan能够显著降低对卡纳霉素有抗性大肠杆菌hb101和对利福平有抗性的nk5449的接合转移频率。
[0080]
使用本发明的方法能够快速检测待测物质对于细菌接合转移能力的影响，尤其是可以在短时间内，快速简易的指示对于耐药细菌接合转移频率的影响。
[0081]
以上所述的实施例仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可以不通过创造性劳动即能够联想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围
应以本技术中权利要求的保护范围为准。