白囊耙齿菌PR2提取物的应用及组合物的制作方法

白囊耙齿菌pr2提取物的应用及组合物
技术领域
1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及白囊耙齿菌pr2提取物的应用及组合物。


背景技术：

2.自然界中，很多植物都会受到病毒侵染而引起病毒病，由于病毒对寄主的绝对寄生性，因此病毒病常有“植物癌症”之称；植物感染病毒后可显著降低作物的产量、品质和货架寿命。由于病毒的变异速度非常快，所以新的病毒毒株不断出现，根据国际病毒分类委员会（the international committee on taxonomy of viruses，ictv）2020年发布的数据，目前已知有大约 1300 种病毒，在我国每年由于病毒感染作物造成的损失高达200亿美元，植物病毒引起的损失已是世界人口生存的威胁之一。
3.目前，植物病毒病的防治主要是采用化学药物，它虽然对病毒病的发生发展起到了一定的防控作用，但同时又带来了环境污染和农药残留等问题。生物源抗病毒剂是一种新的生物农药，具有无毒、不污染环境、无残留、不杀伤天敌、保护人畜安全等特点；并且具有用药量少、持效期长、成本低廉等优点，是实现产业化生物防治的关键。
4.专利cn106399132b《一株白囊耙齿菌及其应用》提供了一种白囊耙齿菌菌株（irpex lacteus）pr2，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.13190；并公开了所述菌株提取物在促进农作物生长或促进农作物增产中的应用，目前没有关于将白囊耙齿菌用于防治植物病毒病的报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供白囊耙齿菌pr2提取物的应用及组合物。
6.为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：本发明提供了白囊耙齿菌pr2提取物在防治植物病毒病中的应用；所述白囊耙齿菌pr2提取物为白囊耙齿菌pr2菌丝体的乙醇提取物。
7.优选地，所述植物病毒病为烟草植株pvx病毒病；所述烟草植株pvx病毒病的病原为马铃薯x病毒。
8.由于所述pr2提取物诱导的是非特异性抗性，所以理论上可以提高植物对多种病毒的抗性，包括烟草花叶病毒、马铃薯y病毒、马铃薯x病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄退绿病毒等。
9.所述白囊耙齿菌pr2提取物的制备包括发酵所述白囊耙齿菌pr2，将发酵液离心过滤，得菌丝体的步骤以及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤。
10.具体地，上述制备方法中，发酵采用的发酵培养基的原料组成为：马铃薯提取液1000ml、酵母膏1.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖15.0g、琼脂17.0g。
11.具体地，所述马铃薯提取液的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。
12.具体地，上述制备方法中，发酵的条件为：接种量为5~15%（体积百分数）、发酵培养温度为20~30℃，培养4~6天。
13.具体地，上述制备方法中，采用乙醇进行提取的步骤为：将菌丝体干燥、粉碎，加入乙醇冷浸20~30h，然后超声提取0.5~1.5h；重复提取2~4次，合并滤液，即得。
14.具体地，所述乙醇提取的操作为：将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液。
15.所述乙醇的加入量为菌丝体（干燥后）重量的15~30%；每次提取加入乙醇的量相同。
16.本发明的另一目的在于，提供一种用于上述应用的组合物，包括上述白囊耙齿菌pr2提取物与氨基寡糖素或褐藻寡糖中的任一种的组合。
17.优选地，所述组合物中白囊耙齿菌pr2提取物与氨基寡糖素的质量比为1:5~5:1。
18.优选地，所述组合物中白囊耙齿菌pr2提取物与氨基寡糖素的质量比为1:3~1:1。
19.优选地，所述组合物中白囊耙齿菌pr2提取物与褐藻寡糖的质量比为1:4~4:1。
20.优选地，所述组合物中白囊耙齿菌pr2提取物与褐藻寡糖的质量比为1:2~2:1。
21.优选地，所述组合物中白囊耙齿菌提取物的浓度为7.5mg/ml，氨基寡糖素和褐藻寡糖的质量百分含量均为90%。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了所述白囊耙齿菌pr2提取物在防治植物病毒病中的应用，所述白囊耙齿菌pr2提取物对植物病毒病的防效远高于现有抗病毒制剂（氨基寡糖素和壳寡糖），提供了一种新的生物源抗病毒制剂，安全高效、对环境友好，有广阔的应用前景；且所述提取物绝对用量少、成本低。
23.本发明所述组合物，在将白囊耙齿菌pr2提取物与氨基寡糖素或褐藻寡糖配合施用后，可以显著提高对植物病毒病的防治效果，防效高于各单剂单独使用，具有显著的增效作用；而且所述白囊耙齿菌pr2提取物与氨基寡糖素或褐藻寡糖配合施用后，在促进植物生长方面也具有显著地增效作用。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
25.白囊耙齿菌pr2提取物的制备：所述白囊耙齿菌pr2提取物可以按照专利cn106399132b中公开的植物诱抗剂的制备方法制得，具体制备方法如下：1.发酵培养：将4℃下保存在试管斜面上的白囊耙齿菌pr2的菌种，接到pda培养基上，25℃培养一周，琼脂挖块接种于装有50mlpda培养液的250ml三角烧瓶，于25℃，180r/min下旋转摇床
上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150ml发酵培养基的500ml三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，得种子液。
26.pda培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
27.发酵培养基配方：马铃薯提取液1.0l，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g，琼脂17.0g。
28.马铃薯提取液的制备：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。
29.2.乙醇提取：将发酵液离心过滤，得菌丝体，将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液，即得。所述乙醇的加入量为菌丝体干燥后重量的20%；每次提取加入乙醇的量相同。
30.实施例1 室内烟草植株pvx病毒病的防治步骤一、烟草培养：取铺满营养土的育苗盘，底部加水浸透后，将烟草种子用镊子点于营养土表面，每穴盘点种四棵，四周支起后覆保鲜膜保湿，放于24℃人工气候室中16/8h培养，待种子萌芽后（点种后十五天左右）揭膜继续培养至3~4叶期，将烟草幼苗移至小花盆中继续培养至4~6叶期即可使用；步骤二、制备带毒汁液：从-80℃冰箱中取出保存的带毒病叶0.1g，加入2ml的pbs研磨成匀浆制备成为带毒汁液备用；步骤三、喷施药剂：分别取氨基寡糖素、褐藻寡糖、白囊耙齿菌pr2提取物单剂作为对照药剂，以氨基寡糖素+白囊耙齿菌pr2提取物、褐藻寡糖+白囊耙齿菌pr2提取物作为试验药剂，并设空白对照，各处理药剂溶于15l水中，用波特喷雾塔定量施药处理烟草，每种药剂处理六株烟草，注意每个叶片喷施均匀；其中，白囊耙齿菌pr2提取物为浓度为7.5mg/ml的溶液；氨基寡糖素和褐藻寡糖均为质量百分含量为90%的原药。
31.步骤四、接种病毒：喷施药剂两小时后用摩擦接种的方法接种烟草系统叶下方的三片真叶，每片真叶接种50μl步骤二制得的带毒汁液，用600目金刚砂摩擦法接种，接种后放至人工气候室内培养5d；步骤五、观察、检测：烟草放入人工气候室内培养5天后，长波紫外灯下观察对照和处理药剂处理的烟草系统叶荧光情况作为表型特征（若出现荧光标记，证明为感病叶片，将其摘取后可放入-80℃冰箱中长期保存）；分别取0.1g对照药剂和试验药剂处理的样品，加入1mlcbs缓冲液一起研磨，研磨液置于离心管中5000r/min，离心5min，取上清液备用，采用酶联免疫法使用酶标仪测定450nm波长下各处理的od值。
32.酶联结果采用spss 21.0软件用duncan法进行统计分析，分析结果如表1~表2所示；若出现显著性差异，即p＜0.05，则视为处理药剂对烟草pvx病毒病的防效有显著促进作用；病毒防效/抑制率计算方法：防效/抑制率（%）=[(对照od
450-处理od
450
)/对照od
450
]
×
100%以每个处理的平均抑制率进行评价防治效果，试验结果如下：表1 各处理对烟草植株pvx病毒病的防效
由表1可知，单施氨基寡糖素0.6g对pvx病毒病的防效在49%左右，单施pr2提取物对pvx病毒病的防效在60%左右，将pr2提取物与氨基寡糖素按照1:5~5:1复配后，对烟草植株pvx病毒病的防效与各单剂之间均存在显著性差异，说明将pr2提取物与氨基寡糖素按照1:5~5:1复配具有显著增效作用，且从上表可以看出，当pr2提取物:氨基寡糖素=1:3时，防效最好。
[0033]
单施褐藻寡糖0.3g对pvx病毒病的防效在46%左右，单施pr2提取物的病毒病的防效在59%左右，将pr2提取物与褐藻寡糖按照1:4~4:1复配后，对烟草植株pvx病毒病的防效与各单剂之间均存在显著性差异，说明将pr2提取物与褐藻寡糖按照1:4~4:1复配具有显著增效作用，且从上表可以看出，当pr2提取物:褐藻寡糖=2:1时，防效最好。
[0034]
实施例2对实施例1最优处理处理后烟草植株及对照处理组处理后烟草植株的株高进行测定分析，试验结果如表2所示；表2 各处理植株的株高
由表2可知，将白囊耙齿菌pr2提取物分别与氨基寡糖素或褐藻寡糖复配后处理的烟草的株高与各单剂相比均有明显增加，且差异显著，说明本技术将白囊耙齿菌pr2提取物分别与氨基寡糖素或褐藻寡糖复配后能够在促进植物生长方面具有增效作用。
[0035]
以上所述实施例仅表达了本技术的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本技术保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。