一种提高仔鱼成活率和抗应激能力的方法与流程

1.本发明涉及水产养殖苗种繁育技术领域，具体涉及一种提高仔鱼成活率和抗应激能力的方法。


背景技术：

2.在当今水产养殖业快速发展的背景下，人们对水产品的需求量也越来越高。但是开口饵料不适口等原因导致人工培育苗种的成活率普遍较低，难以实现稳定的产业化生产，从而制约了水产苗种的大规模生产。大口黑鲈原产于北美洲，因其具有环境适应性强、生长速度快、肉鲜味美等特点，于20世纪70年代末被引入中国。根据《中国渔业统计年鉴》(中国,2021)的最新数据，2020年大口黑鲈产量达到61.95万吨，比2019年的47.78万吨增加了14.17万吨，增幅达29.66％，是淡水经济鱼类中产量增速最快的。大口黑鲈被誉为继中国四大家鱼(青鱼、草鱼、鲢和鳙鱼)之后的“中国第五大家鱼”。大口黑鲈是以肉食为主的杂食性鱼类，仔鱼的开口饲料为轮虫和无节幼虫。卤虫又称丰年虫，是一种世界性分布的小型甲壳类。由于其富含蛋白质、维生素、碳水化合物、矿物质、氨基酸和脂肪酸，成为水产苗种行业优质的饵料。但是卤虫本身硒等营养不足，并不能满足优质种苗生产的需求。硒作为一种抗氧化剂，是许多水生动物生长所需的重要微量元素，在调节甲状腺激素代谢和内分泌系统、细胞信号传导、生长和存活中起着重要作用，被广泛用作养殖动物饲料添加剂。但是硒不能由生物体自然产生，必须从饵料中获得。在生产中可以通过富集技术，将浮游动物缺乏的必需营养物质输送浮游动物体内，改善浮游动物的营养状况。硒化酵母是硒的一种有机来源，可通过将酵母混合于亚硒酸钠中产生。有机来源的硒被认为比无机来源的硒对鱼类的生物利用率更高。用富硒酵母富集卤虫可作为一种优良的硒强化方法，为仔鱼的生长健康带来益处。


技术实现要素：

3.要解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种提高仔鱼成活率和抗应激能力的方法，以解决目前鱼类仔鱼培育中卤虫本身硒等营养元素不足引起仔鱼生长和成活率显著下降的问题。
4.技术方案：一种提高仔鱼成活率和抗应激能力的方法，将富硒营养强化后的卤虫使用滴管吸取活体卤虫直接对仔鱼进行饲喂，饲喂频率为每天投喂4次，每隔6小时投喂一次。进一步的，所述富硒营养强化后的卤虫的制备方法如下：s1：卤虫的孵化：将卤虫休眠卵自冰箱中取出解冻，加入配好的盐水置于孵化桶中，保持温度恒定，孵化期间持续提供光照，采用充气泵不间断提供氧气，获得孵化的卤虫；s2：卤虫的富硒营养强化：将孵化的卤虫通过双层网筛分离得到卤虫无节幼体，分离后将无节幼体重新置于s1所述配置好盐水的孵化桶中，添加酵母硒粉末进行富硒强化24小时；s3：收集富硒营养强化后的卤虫，于网筛中经过流水反复冲洗即得。
进一步的，所述仔鱼为淡水鱼类。进一步的，所述仔鱼为大口黑鲈仔鱼。进一步的，s1所述卤虫孵化盐水盐度为30
‰
，ph保持7～9，光照强度为2000lx，孵化桶外部设28℃恒温水浴装置提供恒定温度，溶解氧大于5mg/l。进一步的，s2中所述双层网筛规格分别为80目和100目。进一步的，s2中酵母硒添加于盐水中，获得酵母硒浓度为5～20mg/l。进一步的，s2中酵母硒中硒含量为3mg/g。有益效果：1、大口黑鲈仔鱼的开口饲料为轮虫和无节幼虫等虫类，所以无法将其它开口饲料富硒对大口黑鲈仔鱼进行饲喂，达到改善仔鱼生长健康状态的目的。本发明采用富硒酵母富集卤虫进行硒强化，硒强化卤虫显著改善了仔鱼生长性能，显著提高了仔鱼成活率和硒含量以及抗氧化性能、抗应激能力，解决了目前鱼类仔鱼培育中卤虫本身硒等营养元素不足引起仔鱼生长和成活率显著下降的问题。2、本发明卤虫无节幼体的酵母硒富集浓度为15mg/l时，能显著提高大口黑鲈仔鱼的体重、体长、特定生长率和硒含量，改善大口黑鲈仔鱼肝脏肠道健康，提升大口黑鲈仔鱼抗氧化性能和抗应激能力。
附图说明
图1为抗氧化指标，其中，(a)肝脏、肠道中的总超氧化物歧化酶(t-sod)活性、(b)肝脏、肠道中的丙二醛(mda)的含量、(c)肝脏、肠道中的过氧化氢酶(cat)活性、(d)肝脏、肠道中的谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性。图2为鱼体肝脏组织切片照片(苏木精-伊红染色，放大400倍)，其中，(a)实施例4、(b)对比例1。图3为鱼体肠道组织切片照片(苏木精-伊红染色，放大400倍)，其中，(a)实施例1(b)实施例2、(c)实施例3、(d)实施例4、(e)对比例1。
具体实施方式
本发明提出了一种提高仔鱼成活率和抗应激能力的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下将配合实施例来对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。养殖试验在西北农林科技大学安康水产试验示范站养鱼房中开展，试验玻璃缸规格(长*宽*高)为：45cm*45cm*30cm，由充气泵连接气石提供氧气，每个玻璃缸中放置加热棒维持恒定温度以及过滤棉用于净水。实施例富不同含量硒卤虫的制备s1：卤虫的孵化：将卤虫休眠卵自冰箱中取出解冻，加入配好的盐水(盐度30
‰
)置于孵化桶(锥形)中进行24小时孵化，孵化期间持续提供光照强度为2000lx的光照，ph8～9，充气泵提供连续充气，孵化桶外部设28℃恒温水浴装置提供恒定温度，获得孵化的卤虫；s2：卤虫的富硒营养强化：将孵化的卤虫通过80目、100目双层网筛分离出卤虫无
节幼体，分离后将无节幼体重新置于s1所述配置好盐水的孵化桶中，添加酵母硒粉末，分别为5mg/l添加组(实施例1)、10mg/l添加组(实施例2)、15mg/l添加组(实施例3)、20mg/l添加组(实施例4)、0mg/l添加组(对比例1)进行富硒强化24小时；s3：收集富硒营养强化后的卤虫，于100目网筛中经过流水反复冲洗后使用滴管吸取卤虫对仔鱼进行饲喂。富硒后卤虫硒含量见表1。表1经酵母硒强化后卤虫的硒含量(mg/kg)1、试验鱼及饲养管理新孵出的大口黑鲈仔鱼来自西北农林科技大学安康水产试验示范站。大口黑鲈亲鱼在池塘自然受精产卵后，将黏附在棕片上的受精卵转移至具备温度22
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1℃、持续微孔增氧条件的室内培育池进行孵化出膜。大口黑鲈仔鱼完全平游后选用体质健康且规格一致的仔鱼开始正式试验。试验共分5个组(实施例1(5mg/l添加组)、实施例2(10mg/l添加组)、实施例3(15mg/l添加组)、实施例4(20mg/l添加组)、对比例1(0mg/l添加组))，每个试验组设3个重复。试验大口黑鲈仔鱼初始平均体长为5mm，初始平均体质量为2.1mg。将3000尾规格一致的大口黑鲈仔鱼分别随机分配至15个经高锰酸钾充分消毒的玻璃缸中(45cm*45cm*30cm)，养殖水体积为45l，每缸仔鱼初始数量为200尾。饲养过程中放置加热棒保持水温24
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1℃，光照周期为12h灯光，12h黑暗，每3天使用桑普水博士水质检测试剂测一次水质。每天投喂4次(分别在6：00、12：00、18：00、24：00进行)经富硒营养强化后的卤虫，投喂时使用5ml滴管吸取卤虫进行等量投喂。试验期间每天进行一次吸污及时清除死鱼及残饵粪便，对各缸死亡仔鱼苗数量进行统计，饲养周期共20天。2、样品采集为期20天的养殖试验结束后，进行取样。将各玻璃缸中的所有鱼捞出，用50mg/l ms222进行麻醉处理后称重，测量体长并记录尾数，用于计算鱼体均重、特定生长率等指标。接着，从每个玻璃缸随机挑选30尾鱼，保存于-20℃冰箱，用于硒含量分析；30尾鱼解剖，分离获取肝脏、肠道，保存于-80℃条件下直至用于酶活等测定分析；再取9尾鱼肝脏肠道经过多聚甲醛固定后用于制作组织切片。最后取10尾鱼进行35℃高温抗应激测试。样品测定1、生长和存活率计算增重率(weight gain rate,wgr)＝(仔鱼末均重-仔鱼初均重)/初体均重特定生长率(specific growth rate,sgr,％/d)＝[ln(鱼末均重)-ln(鱼初均重)]/试验天数
×
100％肥满度(condition factor,cf,g/cm3)＝鱼末均重/体长3×
100％存活率(sr)＝终末鱼体尾数/初始鱼体尾数
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100％2、试验卤虫和仔鱼硒含量测定准确称量卤虫和仔鱼样品0.5g，置于消化管中，加入10ml硝酸和2ml过氧化氢后在微波消解仪中消解，然后再用电热板进行加热至接近蒸干，再加5ml盐酸溶液(6mol/l),继
续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，接着加入2.5ml的铁氰化钾溶液(100g/l)，并定容，最后用原子荧光光度计进行硒含量检测。3、抗氧化酶活性分析准确称取肝脏、肠道组织重量,按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例,加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件下机械匀浆,2500r/min,离心10min,取上清液,分装后4℃冰箱保存待用，8h内完成酶活性测定。样品总超氧化物歧化酶(t-sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活性测定均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行，蛋白浓度用考马斯亮蓝染色法测定。4、脂质过氧化产物分析鱼体肝脏组织中丙二醛(malondialdehyde，mda)的含量反映机体脂质过氧化程度，每缸选择30尾仔鱼采取肝脏进行混样置于-80℃保存待测，mda含量检测采用试剂盒检测(南京建成生物工程研究所，南京市，江苏省，中国)。5、肝肠组织结构检测从试验鱼中采取肝脏和肠道，并快速放置在足量的多聚甲醛组织固定液中至少24小时。通过常规石蜡包埋技术处理固定样品。根据culling(1983)描述的方法，用苏木精和伊红(h&e)对石蜡切片进行染色，并拍照观察样品并使用image view软件测量肠道绒毛长度，并记录数据。6、急性温度应激试验在饲养试验结束时，通过将每缸10尾仔鱼放入35℃恒温水浴缸中进行急性温度胁迫试验。从转入仔鱼后开始计时，以表观死亡即鱼体完全漂浮不再游动为准，记录5尾鱼死亡时间及10尾鱼全部死亡时间。7、数据分析所有试验数据用spss 17.0for windows(spss,il,usa)经正态检验(shapiro-wilk normality test)及方差齐性检验(levene homogeneity of viarance test)后，进行单因素方差分析(one-way anova)，p＜0.05表示差异显著，差异显著时对各处理组均值进行duncan’s多重比较(duncan’s multiply range tests)；所有数据用平均值
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标准差(mean
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se)的方式表示。试验结果1、仔鱼生长和存活率由表2知，在为期20天的饲养试验结束时，经实施例3饲喂的大口黑鲈仔鱼终末体重与实施例1无显著差异(p＞0.05)，但显著高于对比例1、实施例2以及实施例4(p《0.05)；经实施例3饲喂的大口黑鲈仔鱼终末体长与实施例1、实施例2差异不显著(p＞0.05)，但显著高于对比例1和实施例4(p《0.05)；经实施例3饲喂的大口黑鲈仔鱼特定生长率与实施例1无显著差异(p＞0.05)，但显著高于对比例1、实施例2以及实施例4(p《0.05)；饲喂不同浓度富硒卤虫的大口黑鲈仔鱼的硒含量呈梯度递增趋势，各组之间硒含量差异均显著(p《0.05)；经实施例3喂食的大口黑鲈仔鱼成活率显著高于其他试验组(p《0.05)；其他试验组间无显著差异(p》0.05)。表2投喂酵母硒强化卤虫对大口黑鲈仔鱼生长、硒含量及成活率的影响
数据表示为平均值
±
标准差，每行上标字母不同，表示差异有显著性意义(p＜0.05)。2、抗氧化能力饲喂不同浓度富硒酵母强化卤虫对大口黑鲈仔鱼抗氧化能力的影响如图所示，由图1a可知，随着培养卤虫的酵母硒添加浓度升高，大口黑鲈仔鱼肝脏中过氧化氢酶(cat)活性呈现出先增后降的趋势，其中实施例2、实施例3和实施例4中cat活性显著高于对照组(p《0.05)；由图1b可知，随着培养卤虫的酵母硒添加浓度升高，大口黑鲈仔鱼鱼体中的谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性呈现出先增后降的趋势,其中各实施例中gsh-px活性均显著高于对比例1(p《0.05)；由图1c可知，饲喂经不同浓度水平富硒酵母强化卤虫后，大口黑鲈仔鱼肝脏中的总超氧化物歧化酶(t-sod)活性呈现出先升高再降低再升高的趋势，其中实施例1、实施例2和实施例4中t-sod活性与对比例1无显著差异(p＞0.05)，实施例3中t-sod活性显著低于实施例1(p《0.05)；由图1d可知，饲喂经不同浓度水平富硒酵母强化卤虫后，实施例2、实施例3和实施例4大口黑鲈仔鱼鱼体中的丙二醛(mda)含量显著低于对比例1(p《0.05)。3、肝肠组织结构对比例1大口黑鲈仔鱼肝脏的组织切片观察显示，肝细胞存在空泡化比较严重，细胞核偏位的问题(图2a)。而在实施例3中观察到的仔鱼肝组织中未见病理变化，以维持正常的肝脏结构(图2b)。此外，各实施例大口黑鲈仔鱼肠道组织病理学检查结果与对比例1相比绒毛长度显著增加(图3a-e)。此外，杯状细胞数量随着酵母硒浓度的增加而减少。表3投喂酵母硒强化卤虫对大口黑鲈仔鱼肠道绒毛长度的影响数据表示为平均值
±
标准差，每行上标字母不同，表示差异有显著性意义(p＜0.05)。4、急性温度应激能力由表4知，在进行35℃急性温度应激试验后，各实施例大口黑鲈仔鱼在35℃应激处理后半数致死时间无显著差异(p＞0.05)；全部致死时间实施例3和实施例4之间无显著差异(p＞0.05)，但都显著高于对比例1、实施例1以及实施例2(p《0.05)。表4投喂酵母硒强化卤虫对大口黑鲈仔鱼35℃应激致死时间的影响
数据表示为平均值
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标准差，每行上标字母不同，表示差异有显著性意义(p＜0.05)。基于本研究的结果，利用富硒酵母作为硒源对卤虫无节幼体进行营养强化之后作为开口饵料饲喂大口黑鲈仔鱼对其有一定的正向效应。研究发现，实施例3酵母硒营养富集的卤虫饲喂大口黑鲈仔鱼效果最佳，可显著促进大口黑鲈仔鱼生长性能，提高存活率，改善肝肠组织结构。此外，对于大口黑鲈仔鱼的抗氧化性能以及抵抗高温应激的能力都产生积极影响。因此，使用经酵母硒强化卤虫对大口黑鲈仔鱼进行饲喂可能是提高仔鱼期养殖经济效益的一种有效方式。