一种聚丙烯酸修饰的Mn3O4纳米颗粒在提高作物高温抗性中的应用

一种聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒在提高作物高温抗性中的应用
技术领域
1.本发明属于作物抗逆技术领域。更具体地，涉及一种聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒在提高作物高温抗性中的应用。


背景技术：

2.非生物胁迫是指不利于作物生存和生长发育甚至导致其被伤害、破坏和死亡的非生物环境条件，包括低温、高温、干旱、盐渍、水淹、过量光、紫外线辐射、矿质营养亏缺、氧气缺乏、大风、伤害，以及空气、土壤或水体污染如重金属、农药、臭氧和二氧化硫污染等。在我国，农作物受非生物胁迫的情况时有发生，特别是盐胁迫和热胁迫(高温)，其中，热胁迫是指作物在高温下生存的一种逆境，高温会对作物的生理和代谢变化产生不利影响，对蛋白质造成严重损害，干扰其合成，使主要酶失活并损坏膜结构，这些损害都会严重限制植物的生长，产生氧化损害，从而影响作物的生长、产量与品质。
3.目前应对高温胁迫的常规方式为使用生长调节剂、渗透保护剂进行处理(kolupaev ye,akinina ge,mokrousov av.induction of heat tolerance in wheat coleoptiles by calcium ions and its relation to oxidative stress.russian journal of plant physiology,2005,52:199-204.)。其中生长调节剂通过调节酶活性来提高光合速率并保持细胞膜的稳定性来提高作物的高温胁迫抗性；渗透保护剂通过控制多种细胞过程，如增强抗氧化酶活性和降低热胁迫下的脂质过氧化来减轻热胁迫对作物的损伤来提高作物的抗高温胁迫性；但上述方法都存在抗高温胁迫效果差、成本高、极易造成环境污染等弊端。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服在现有抗非生物胁迫方法中，面对其抗高温胁迫效果差、成本高、极易造成环境污染的缺陷和不足，提供一种聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒在提高作物高温抗性中的应用。
5.本发明的上述目通过以下技术方案实现：
6.一种聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒在提高作物高温抗性中的应用。
7.优选地，所述聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒的制备方法为：将锰盐溶于纯水中得锰盐溶液，将聚丙烯酸(paa)溶于纯水中得聚丙烯酸溶液；将锰盐溶液与聚丙烯酸溶液混合后得到a溶液；将a溶液逐滴加入到30～40wt％氨水中，搅拌20～30小时后，100～130℃水热反应20～30小时后离心，取上清，纯化即得。
8.优选地，所述锰盐为硫酸锰、硝酸锰或氯化锰。
9.优选地，所述锰盐溶液的浓度为0.8～1.2mol/l。
10.优选地，所述聚丙烯酸溶液的浓度为800～1000g/l。
11.优选地，所述锰盐溶液与聚丙烯酸溶液的体积比为1：(1.5～2.5)。
12.优选地，所述a溶液与氨水的体积比为1:(1.5～2.5)。
13.优选地，所述作物为棉花。
14.优选地，所述聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒通过维持作物内活性氧稳态来提高作物的高温抗性。
15.优选地，所述聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒通过维持作物内铁稳态来提高作物的高温抗性。
16.更优选地，所述铁稳态中的铁为二价铁或三价铁。
17.优选地，所述应用的方法为：将聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒和表面活性剂混合制成分散液均匀喷洒在作物叶面上。
18.优选地，所述分散液中聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒的浓度为80～120mg/l。
19.更优选地，所述分散液中聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒的浓度为90～110mg/l。
20.优选地，所述表面活性剂占聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒分散液的0.02～0.05％。
21.更优选地，所述表面活性剂占聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒分散液的0.03～0.04％。
22.优选地，所述表面活性剂为有机硅表面活性剂。
23.更优选地，所述有机硅表面活性剂为silwet l-77。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明中聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒能显著降低作物叶片因受到高温胁迫而升高的活性氧和铁的含量，以达到维持作物叶片中活性氧稳态和铁稳态的效果，通过维持作物中活性氧的稳态及铁稳态而显著增强作物对热胁迫的抗性(高温抗性)，且聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒成本低、绿色安全，适合大规模应用。
附图说明
26.图1为三组棉花经高温胁迫7天后的表型图，a为生长状态图、b为光合指标图、c为重量图，其中a,b代表显著水平，b相对于a来说p值为0.05，*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
27.图2为pmo在棉花叶片中位置研究的结果图，a为pmo叶面喷施3h后进入叶肉细胞叶绿体中的图片，b为pmo在棉花第一、二片真叶叶绿体中的共定位率结果图。
28.图3为染料法测定pmo对棉花叶片中h2o2和o2·-的影响结果图，a为dcf染料监测h2o2的共聚焦成像图，b为dcf荧光统计图，c为dhe染料监测o2·-的共聚焦成像图，d为dhe荧光统计图。
29.图4为染料法测定pmo对棉花叶片中
·
oh的影响结果图，a为hpf染料监测体内
·
oh的共聚焦成像图，b为hpf荧光统计图。
30.图5为试剂盒检测pmo对棉花叶片中h2o2和
·o2-的影响结果图，a为pmo对棉花叶片中h2o2含量的影响结果图，b为pmo对棉花叶片中的
·o2-含量的影响结果图，其中，*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
31.图6为pmo对棉花叶片内细胞活性的影响结果图，a为dapi染料监测棉花叶片细胞活性的共聚焦成像图，b为a图中的死细胞的数量统计图，c为pi染料监测棉花叶片细胞活性
的共聚焦成像图，d为c图中的死细胞的数量统计图，其中，*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
32.图7为pmo对棉花叶片内fe
2+
的影响结果图，a为fe
2+
在棉花叶肉细胞中的分布图，b为fe
2+
荧光统计图，其中，**代表p《0.01。
33.图8为pmo对棉花叶片内fe
3+
的影响结果图，a为棉花叶片的普鲁士蓝染色图，b为a图普鲁士蓝染色荧光统计图，其中，*代表p《0.05。
34.图9为pmo对棉花叶片内mda的影响结果图，其中，**代表p《0.01。
具体实施方式
35.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
36.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
37.实施例1聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒(pmo)的制备
38.将0.425g mnso4·
h2o溶于2.5ml纯水中得硫酸锰溶液，将4.5g聚丙烯酸(paa，重均分子量为1800)溶于5ml纯水中得聚丙烯酸溶液；将硫酸锰溶液与聚丙烯酸溶液混合后，在涡旋仪上以2500rpm混合15分钟，得到a溶液；将a溶液逐滴加入到15ml的30wt％氨水(sigma)中，在磁力搅拌器上以500rpm搅拌24小时后放入到50ml的聚四氟乙烯反应釜中，120℃水热反应24小时后分装在2ml离心管中，6000g常温离心1小时，取上清，用透析袋(mw 3500)透析24小时，每8小时换一次水，得到聚丙烯酸修饰的mn3o4纳米颗粒(pmo)。
39.实施例2pmo提升高温胁迫下棉花的生长状态
40.叶绿素荧光成像
41.pmo组：使用含有0.04％silwet l-77的100mg/l pmo分散液；
42.mnso4对照组(无机盐对照组)：使用含有0.04％silwet l-77的13.72mg/l mnso4混合溶液；
43.ctrl对照组：使用含有0.04％silwet l-77的分散液；
44.本试验选用品种为新疆主栽棉花品种新陆早74号(xlz74)，以hogland营养液水培，生长温度25℃22℃，湿度60％，光照强度为200μmol m-2
s-1
par，光照周期为14/10h(白天/黑夜)，待棉花幼苗长到二叶期时，对棉花幼苗叶面喷洒pmo组、mnso4对照组、ctrl对照组的处理液，喷洒完毕后用纸巾拭去叶面多余溶液，将处理后的棉花幼苗放于弱光处适应3h后进行高温处理(45℃/42℃，14h/10h)，高温处理7天后，取第1片真叶(1
st leaf)、第2片真叶(2
nd leaf)测定各项指标。采用叶绿素荧光成像系统(德国walz)对上述3组处理后的棉花叶片进行测定。测定以下参数：初始荧光(f0)、最大荧光产量(fm)、最大光化学效率(fv/fm)和非光化学淬灭系数(npq)。
45.结果如图1所示：叶片涂抹pmo的棉花无论在生长状态(图1中a)、光合指标(图1中b)、鲜重(fersh weight，图1中c)中的表现都优于其他两组处理，干重(dry weight)变化不明显。
46.实施例3pmo在棉花叶片中位置的研究
47.dii-pmo合成
48.将0.8ml 9g/l的pmo和7.2ml去离子水混合在20ml的玻璃烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌(500r/min)得pmo溶液，取24μl的荧光染料dii(1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'四甲基吲哚羰花青)(2.5mg/ml)溶于176μl二甲亚砜(dmso)中得dii染液，将dii染液逐滴滴加到pmo溶液中，室温条件下于磁力搅拌器上以1000r/min搅拌1min得混合溶液(dii-pmo)，将混合溶液(dii-pmo)转移至15ml(mwco 10kd，millipore)超滤管中，添加去离子水使最终体积为15ml，4000g离心5min，重复这一步骤5～7次最终得到dii-pmo溶液用于荧光定位，将其储存在4℃冰箱备用。
49.对棉花的处理
50.分组情况如下：
51.dii-pmo组：使用含有0.04％silwet l-77的100mg/l dii-pmo分散液；
52.ctrl对照组：使用含有0.04％silwet l-77的分散液；
53.本试验选用品种为新疆主栽棉花品种新陆早74号(xlz74)，以hogland营养液水培，生长温度25℃22℃，湿度60％，光照强度为200μmol m-2
s-1
par，光照周期为14/10h(白天/黑夜)，待棉花幼苗长到二叶期时，对棉花幼苗叶面喷洒dii-pmo组和ctrl对照组的处理液，喷洒完毕后用纸巾拭去叶面多余溶液，将处理后的棉花幼苗放于弱光处适应3h后施加高温处理(45℃/42℃，14h/10h)，高温处理7天后，取第1片真叶(1
st leaf)、第2片真叶(2
nd leaf)测定dii-pmo在棉花真叶中与叶肉细胞中的叶绿体(chloroplast)共定位率(colocalization rate)。
54.结果如图2所示：dii-pmo与叶绿体覆盖后的荧光图像(overlay)显示，叶面喷施3h后进入叶肉细胞中(图2中a)，与ctrl组相比，dii-pmo在棉花第一片真叶中与叶肉细胞中的叶绿体共定位率可以达到20％，第二片真叶的共定位率约为26％(图2中b)，证明pmo能进入棉花第一片真叶与第二片真叶的叶绿体中。
55.实施例4pmo对棉花叶片内活性氧含量的影响
56.pmo组：使用含有0.04％silwet l-77的100mg/l pmo分散液；
57.ctrl对照组：使用含有0.04％silwet l-77的分散液；
58.荧光染料定量法检测：
59.使用激光共聚焦显微镜对棉花幼苗叶片内活性氧进行研究。使用二氢乙锭(dhe)和2
′
,7
′‑
二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcf)以及羟基苯基荧光素(hpf)作为活性氧(h2o2、
·o2-、
·
oh)的荧光染料。取上述两组处理后的棉花叶片按照实施例1的方法高温处理后(使用直径5mm的打孔器在真叶上打孔)浸泡于25μm h2dcfda或10μm dhe或10μm hpf染料(用10mm tes稀释，ph＝7.5)中，黑暗条件下孵育30min。孵育结束后，用tes缓冲液冲洗三次，并将其装入载玻片内(预先在载玻片上滴加一滴全氟萘胺(pfd)以增强荧光成像效果)，盖上盖玻片，并且确保没有气泡。激光共聚焦显微镜设置如下：40倍物镜，488nm激发光；pmt1：500nm～600nm(dhe、dcf、hpf)；pmt2：700nm～800nm(叶绿体)；作4～6次重复，使用image j软件计算dcf和dhe及hpf荧光强度。
60.结果如图3所示：dcf与dhe染料分别监测叶片中的h2o2和
·o2-，经pmo处理的棉花第一片真叶与第二片真叶均比ctrl对照组具有更少的h2o2(图3中a和b)，经pmo处理的棉花第一片真叶中
·o2-的含量比ctrl对照组显著降低，第一片真叶中
·o2-的含量无明显变化(图3中c和d)，证明pmo具有清除棉花第一片真叶与第二片真叶中的h2o2，和第一片真叶中
的
·o2-的作用。
61.如图4所示：羟基苯基荧光素(hpf)作为活性氧(
·
oh)的荧光染料，经pmo处理的棉花叶片比对照组具有更少的
·
oh含量，ctrl对照组的第二片真叶对比第一片真叶表现出更高的
·
oh含量，证明pmo具有清除棉花第一片真叶与第二片真叶中
·
oh的作用，且第二片真叶的清除效果更好。
62.试剂盒检测棉花叶片中活性氧的含量：
63.过氧化氢(h2o2)含量测定使用“过氧化氢含量测定试剂盒”(a064-1-1，南京建成生物有限公司)进行测定，按照说明书执行操作。准确称取两组处理后的棉花叶片样品0.1g，加入1ml生理盐水，使用研磨仪研磨120sec(65hz)，12000g，4℃下离心20min，取上清液待用。按照说明书加样流程加样，混匀后以波长405nm，光径1cm，测定吸光度值。
64.超氧阴离子(
·o2-)含量测定使用“超氧阴离子含量测定试剂盒”(北京索莱宝科技有限公司)，按照说明书进行。准确称取两组处理后的棉花叶片样品0.1g，加入1ml
·o2-lysis buffer使用研磨仪研磨180秒(65hz)，10000g，4℃下离心10分钟，取上清液待用。按照说明书加样流程加样，以空白调零，分光光度计测定样品530nm处吸光度值。
65.结果如图5所示：经pmo处理的棉花叶片比ctrl对照组具有更少的h2o2含量(图5中a)、
·o2-含量也在第一片真叶中显著下降(图5中b)，证明pmo处理有助于清除棉花第一片真叶与第二片真叶中的h2o2，和第一片真叶中的
·o2-。
66.高温胁迫会使叶片产生较多的活性氧造成氧化损伤，结果表明，pmo能显著降低棉花叶片中ros的含量，与荧光染料检测的结果一致，证明本技术的pmo能够维持叶片中ros稳态从而提高叶片的抗高温胁迫性能。
67.实施例5pmo对棉花叶片中细胞活性的影响
68.dapi与pi染料可以与细胞核中dna结合从而发出荧光，细胞活性降低后细胞膜通透性改变从而使染料容易进入细胞核，因此被dapi与pi结合的细胞活性降低。
69.使用0.05m磷酸钠缓冲液(pbs，ph＝7.4)配置50μg/l碘化丙啶(pi)/4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染液。实施例4中的两组棉花叶片按照实施例1的方法高温胁迫7天后，使用打孔器(直径5mm)于真叶上打孔取下叶盘。将叶盘浸泡于pi染料中，4℃条件下孵育1h。将叶盘浸泡于dapi染料中，常温条件下孵育5min。结束后，用去离子水冲洗叶盘三次，并将其装入载玻片内(预先在载玻片上滴加一滴全氟萘烷(pfd)以防止荧光猝灭)，盖上盖玻片，并且确保玻片间没有气泡。激光共聚焦显微镜参数设置如下：40倍物镜，pi:514nm激发光，强度30％；pmt1：610nm-630nm(pi荧光)；pmt2：700nm-800nm(叶绿体荧光)；dapi:405nm激发光，强度30％；pmt1：435nm-500nm(dapi荧光)；pmt2：700nm-800nm(叶绿体荧光)作3～6次重复，统计单张视野内死细胞数量。
70.如图6所示：用dapi(图6中a和b)与pi(图6中c和d)染料染色后，经pmo处理的棉花叶片比ctrl对照组具有更强的细胞活性，并且第一片真叶的细胞活性要高于第二片真叶，证明用pmo处理后，在高温条件下，棉花叶片细胞的生长情况更好，pmo可以显著提高棉花的高温抗性。
71.实施例6pmo对棉花叶片内二价铁离子的影响
72.用ferroorange(dojindo japan)作为铁离子(fe
2+
)的荧光染料；以fm 4-64(thermo fisher scientifc)作为质膜染料可以帮助区分液泡和细胞质位置。将实施例4两
组处理后的棉花叶片，经实施例1的方法高温处理后用打孔器(直径5mm)于棉花真叶上打孔取下叶盘。用tes缓冲液(10mm，ph＝7.5)将ferroorange稀释到1μm，fm 4-64探针稀释到20μm。将叶盘浸泡于ferroorange与fm 4-64混合染液进行fe
2+
染色，黑暗条件下孵育30min。孵育结束后，用tes缓冲液冲洗叶盘3～5次，并将其装入载玻片内(预先在载玻片上滴加一滴全氟萘烷(pfd)以防止荧光猝灭)，盖上盖玻片，并且确保没有气泡。激光共聚焦显微镜设置如下：40倍物镜，514nm激发光；pmt1：550nm～585nm(fe
2+
荧光)；610nm～660nm(质膜荧光)；作4～6次重复，使用image j软件计算fe
2+
荧光强度。
73.结果如图7所示：ferroorange作为fe
2+
荧光探针(图中绿色荧光部分)监测其在叶片中的分布，将视野放大6倍(zoom＝6)，结果显示fe
2+
主要分布于细胞质(红色箭头)中，而pmo处理的棉花叶肉细胞细胞质中的fe
2+
明显降低，而液泡(黄色箭头)中的fe
2+
并没有增加(图7中a)，图7中b也显示与ctrl对照组相比，pmo组处理过的棉花真叶中的二价铁离子含量显著降低。这表明pmo处理组并非通过将细胞质中的fe
2+
转运至液泡中而是通过减少细胞对fe
2+
摄入的方式来维持细胞内的铁稳态。
74.实施例7pmo对棉花叶片内三价铁离子的影响
75.植物组织内的高价铁与亚铁氰化钾反应可生成不可溶的蓝色沉淀(普鲁士蓝)。因此，普鲁士蓝染色可以检测棉花叶片中fe
3+
分布。
76.溶液配制：
77.4％盐酸(a液)：取2ml浓盐酸溶于50ml去离子水中；
78.4％亚铁氰化钾(coolaber)(b液)：2g亚铁氰化钾溶于50ml去离子水中。
79.染色液：将a液和b液等量混合，放置15分钟后，方可用于染色。
80.取实施例4两组处理后的棉花叶片，按照实施例1的方法进行高温处理后整个浸入染色液中，并抽真空10min帮助染液浸入叶片，后经去离子水冲洗三次，用无水乙醇：甘油＝9:1脱色液煮沸进行叶片脱色，经无水乙醇：甘油＝6:4混合液进行叶片软化，使用照相机拍照观察。
81.结果如图8所示：棉花经过7天高温胁迫后，与ctrl对照组相比，pmo组第一片真叶的普鲁士蓝显色情况无明显变化，第二片真叶的普鲁士蓝显色情况显著降低(图8中a)，pmo处理组在第二片真叶中显著降低fe
3+
含量(图8中b)，表明pmo使用后棉花总体上降低了叶片中三价铁离子的含量，从而提高棉花叶片的高温抗性。
82.叶片在受到高温胁迫后，叶片中的h2o2与fe
2+
发生芬顿反应产生羟基自由基进而造成脂质过氧化，fe离子浓度降低能有效维持铁稳态，可见，pmo处理后二价铁离子和三价铁离子的含量显著降低，能有效维持棉花叶片内的铁稳态。
83.实施例8pmo对棉花叶片中mda的影响
84.植物器官在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(mda)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一。
85.称取0.15g实施例4两组棉花叶片样品，按照实施例1的方法进行高温处理后，加入1.5ml 5％三氯乙酸(tca)，使用研磨仪研磨180秒(65hz)，12000g，4℃下离心20分钟，取上清液待用。取上清液1ml，加入1ml 0.67％硫代巴比妥酸(tba)，混合后沸水浴30min，冷却后离心。以去离子水代替提取液的混合液为对照，测定上清液450nm、532nm和600nm处吸光度，作4次重复，根据以下公式计算丙二醛(mda)含量：
86.mda含量(mmol/g fw)＝[6.452
×
(a
532-a
600
)-0.559
×a450
]
×
[2
×v×
w]
[0087]
w为棉花叶片质量(g)；v为测定时取用上清液体积(ml)
[0088]
结果如图9所示：pmo处理组的mda含量显著少于ctrl对照组，证明了用pmo处理后，棉花受到高温胁迫的程度显著降低。
[0089]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。