一种玛瑙红樱桃离体培养及植原体脱除的方法

本发明属于植物脱植原体及离体培养，具体涉及一种玛瑙红樱桃离体培养及植原体脱除的方法。

背景技术：

1、玛瑙红樱桃是蔷薇科李属樱桃亚属植物，目前在贵州省内广泛种植，同时周边省市也已大量引种种植。

2、植原体又称类菌原体(mlo)，是一类由生物膜包围，无细胞壁，存在于植物韧皮部筛管细胞，类似植物病原细菌，不能人工培养的单细胞原核生物。植原体传播速度快、传播途径广、病害严重，尚无有效的化学治疗手段，一经感染，樱桃植株会表现出花变叶、丛枝病、花变绿病、叶片黄化、植株衰退的现象，严重影响樱桃质量及产量，目前在贵州大部分玛瑙红樱桃主产区均检测到了植原体病原。

3、植原体病害检测和鉴定的主要方法是根据植原体的保守基因设计特异性引物进行pcr扩增和rflp分析，如16srdna基因、核糖体蛋白基因(rp)、延伸因子基因(tuf)等。

4、高温可钝化植原体，明显减弱或抑制植原体在植物体内的繁殖，同时植株根尖和芽尖的分生组织内植原体含量少或不含植原体，通过微茎尖组织培养可有效脱除植物体内的植原体，热处理结合茎尖培养是目前来说比较高效的脱除植原体的方法。为了保证玛瑙红樱桃产业可持续发展，建立一种玛瑙红樱桃种苗植原体脱除体系非常必要。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：提供了一种玛瑙红樱桃离体培养及植原体脱除的方法。

2、本发明的技术方案是：一种玛瑙红樱桃离体培养及植原体脱除的方法，包含以下步骤：

3、(1)材料采集：于12月采集休眠芽样品，4月采集叶片样品，快速放于液氮中保存，用于植原体检测；前期检测有植原体的玛瑙红樱桃植株，于12月采集带有休眠芽的枝条用于组织培养及植原体脱除；

4、(2)田间材料植原体检测：提取玛瑙红樱桃叶片、休眠芽基因组dna，根据植原体16srdna序列通用引物r16mf2/r16mr2和r16f2n/r16r2进行巢氏pcr扩增，pcr产物经琼脂糖电泳检测，若pcr产物中未扩增出特异性dna片段，则判断样品中没有感染植原体，若pcr产物中扩增出特异性dna片段，则判断样品中感染植原体；

5、(3)外植体的处理：切取带休眠芽的茎段，剥除休眠芽外部2～3层鳞片，将带休眠芽茎段用洗洁精浸泡刷洗、清水清洗后，移入超净工作台；带休眠芽茎段用酒精消毒，无菌水清洗2～3次，1％升汞溶液加两滴吐温灭菌，无菌水冲洗5～7遍至瓶内无泡沫；

6、(4)休眠芽茎尖萌发：将处理好的带休眠芽茎段取出放于滤纸上吸干水分，于解剖显微镜下剥取灭菌后带1～2个叶原基的休眠芽茎尖，接种到茎尖萌发培养基上，放置于培养室内光照培养；

7、(5)增殖培养：待茎尖诱导出的芽长至1.5cm时可移入增殖培养基，放置于培养室内进行增殖培养；

8、(6)继代组培苗遗传变异的issr检测：取第1代至第5代玛瑙红樱桃组培苗，每代随机选取3株组培苗，提取组培苗嫩叶基因组dna，采用筛选出的21条issr引物，以各代组培苗dna为模板进行pcr扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后记录条带数，出现频率高于99％的条带记为共有带；

9、(7)生根培养：待组培苗继代后，选择带4～5片舒展叶片的健壮增殖苗转移至生根培养基中诱导生根；

10、(8)组培苗热处理：将巢氏pcr检测带植原体的继代培养组培苗放置于人工气候培养箱内，每天升高2℃至38℃处理21d；

11、(9)茎尖剥离：选取经热处理后生长健壮的樱桃组培苗，剥取顶端带1～2个叶原基的长度为0.1～1.5mm的茎尖，接种至茎尖萌发培养基中进行离体培养；

12、(10)将步骤(9)茎尖诱导出的组培苗分好株系，经过与步骤(5)相同的处理后即可获得大量的组培苗；

13、(11)脱植原体效果检测：将步骤(10)的组培苗采用巢氏pcr法进行与步骤(2)相同的植原体检测，每个茎尖长度梯度随机选取5个不同株系的组培苗叶片进行检测，重复3次；

14、(12)玛瑙红樱桃脱植原体组培苗的增殖：经步骤(11)植原体检测后为阴性的组培苗株系采用与步骤(5)相同的方法进行脱病组培苗的增殖培养；

15、(13)玛瑙红樱桃脱植原体苗的获得：将步骤(12)脱病组培苗转入与步骤(7)相同的生根培养基中，经炼苗驯化后移栽即可得到完整的玛瑙红樱桃脱植原体植株。

16、所述步骤(2)中，用于植原体检测的21对引物的核苷酸序列如序列表1。

17、表1 16srdna基因巢氏pcr扩增引物

18、

19、所述步骤(2)中，用于植原体检测的pcr扩增程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸7min，第一次pcr扩增产物稀释10倍，以r16f2n/r16r2为引物进行第二次扩增，除了循环内72℃延伸时间改为1min 30s，其余程序与第一次扩增相同。

20、所述步骤(2)中，用于植原体检测的pcr扩增反应体系为：模板1μl，10×pcr缓冲液2μl，2.5mmol/l dntp 1.5μl，5u/μl taqdna聚合酶0.25μl，10μmol/l正反引物各1μl，加ddh2o至20μl。

21、所述步骤(2)产物中，pcr产物电泳检测步骤如下：取pcr产物5μl，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳缓冲液用2×tae，电泳的电压为150v，电泳约25min后取出凝胶在紫外灯下观察。

22、所述步骤(4)中，茎尖萌发培养基组分为：ms+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+6-ba 1.0mg/l+iba 0.2mg/l+tdz 0.3mg/l。

23、所述步骤(5)中，组培苗增殖培养基的组成为：ms+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+6-ba1.0mg/l+iba 0.1mg/l+ga3 1.5mg/l。

24、所述步骤(6)中，用于issr检测的21对引物的核苷酸序列如序列表2。

25、表2 issr-pcr扩增引物

26、 引物 序列 引物 序列 m01 cacacacacacar 840 gagagagagagagagayt m03 caccacacacarg 846 cacacacacacacacart m05 gctgctgctgcty 862 agcagcagcagcagcagc m08 agcagcagcagcay 863 agtagtagtagtagtagt 807 agagagagagagagagt 864 atgatgatgatgatgatg 808 agagagagagagagagc 866 ctcctcctcctcctcctc 811 gagagagagagagagac 868 gaagaagaagaagaagaa 812 gagagagagagagagaa 873 gacagacagagagaca 815 ctctctctctctctctg 876 gatagatagacagaca 816 cacacacacacacacat 880 ggagaggagaggaga 836 agagagagagagagagya  

27、所述步骤(6)中，issr-pcr扩增反应体系为10μl，其中引物1μl，模板1μl(约40ng)，ddh2o 3μl，mix(天根生化科技有限公司2×taq plus master mix)5μl。

28、所述步骤(6)中，issr-pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，tm(退火温度由引物而定)退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。

29、所述步骤(7)中，组培苗生根培养基的组成为：ms+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+iba0.5mg/l+naa 0.3mg/l

30、所述步骤(9)中，剥取茎尖长度分为0.1～0.3mm、0.3～0.6mm、0.6～1.0mm、1.0～1.5mm。

31、所述步骤(13)中，炼苗移栽的要求为：待组培苗长出4～6条不定根、高约2.5cm时将组培瓶盖打开，开口炼苗3d后移栽至已灭菌的基质中。

32、所述培养条件为：温度保持25±2℃，光照时间12h/d，光照强度3000-5000lux，培养基ph均为5.8。

33、本发明的有益效果：本方法提供的一种玛瑙红樱桃离体培养及植原体脱除的方法，首先以培育玛瑙红樱桃无菌苗的方式，热处理后将此无菌苗经茎尖剥离进行培养，即可获得玛瑙红樱桃脱植原体苗，此方法获得的脱植原体苗比直接采用茎尖剥离培养法的脱植原体率更高，以此方法进行玛瑙红樱桃脱植原体苗的培育可在短时间内获得大量脱病率高且生长健壮的无病苗，为玛瑙红樱桃脱植原体苗的工厂化培育提供了技术基础。