一种白肉灵芝液体菌种的生产方法与流程

1.本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种白肉灵芝液体菌种的生产方法。


背景技术：

2.灵芝(ganoderma lucidum)来源于多孔菌科(polyporaceae)灵芝属(ganoderma)，具有养心安神、止咳平喘的功效。白肉灵芝(ganoderma leucocontextum t.h.li et al.)发现于中国西藏，分布于西藏、四川、云南等高海拔地区，2015年由广东省科学院微生物研究所科研人员鉴定、命名并发表为灵芝新品种。与其他灵芝需在中高温度下生长不同，白肉灵芝出芝温度低，最适温度为20-22℃。白肉灵芝与国内广泛栽培的灵芝品种外形较相似，但菌肉较白，在四川和西藏等地被视为高品质的种类，售价比一般的灵芝高出数倍。研究表明，白肉灵芝的多糖含量明显高于普通灵芝，同时功效研究表明其提取物具有多种生物活性，在抗肿瘤、调节免疫、降血糖降血脂、代谢调节等方面效果显著。
3.相较于传统固体菌种，液体菌种因其具有生产成本低、生长周期短、菌种活力强、纯度高、可实现自动化生产的显著优势，被越来越多的食用菌工厂化种植企业所选择。
4.目前关于白肉灵芝液体菌种的生产方式相关报道较少，专利cn 114766285 a公开了一种白肉灵芝属菌株l4495的栽培方法，采用由可溶性淀粉，黄豆粉，磷酸二氢钾，mgso4·
7h2o，vb2，水；ph＝6.9-7.1的液体培养基培养菌种。该专利技术主要针对液体培养基的碳源、氮源、发酵温度、发酵ph值及无机盐配比进行调整，以缩短培养时间。但该专利并未对菌种进行纯化处理，且并未对影响菌丝生长活力的因素进行研究。


技术实现要素：

5.针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种白肉灵芝液体菌种的生产方法。本发明方法可更好的推进白肉灵芝的大规模种植推广。
6.本发明目的通过以下技术方案实现：
7.一种白肉灵芝液体菌种的生产方法，包括如下步骤：
8.(1)母种培养基的配置：配置综合pda培养基、加富pda培养基，其中综合pda培养基原料由土豆、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁组成；加富pda培养基的原料在综合pda培养基的基础上添加蛋白胨；
9.(2)液体菌种的制作及纯化：挑取白肉灵芝幼嫩子实体组织块接种于加富pda培养基上，黑暗条件下培养，然后挑选距离接种块2cm以外的菌种块接入综合pda培养基上，黑暗条件下培养，挑取距离接种点2cm外的纯化母种菌块备用；
10.(3)液体培养基配制：以蔗糖、玉米浆浸膏、酵母粉、玉米淀粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素为原料配制液体培养基，调节ph值为5.0，分装后密封，高压蒸汽灭菌，冷却备用；
11.(4)接种及培养：将步骤(2)所得纯化母种菌块接种至步骤(3)的液体培养基中培养，得到白肉灵芝液体菌种。
12.进一步地，步骤(1)中所述综合pda培养基中各原料浓度为土豆20g/l、葡萄糖20g/
l、琼脂20g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁1.5g/l。
13.进一步地，步骤(1)中所述加富pda培养基中蛋白胨的用量为8g/l。
14.进一步地，步骤(2)中所述接种于加富pda培养基的白肉灵芝幼嫩子实体组织块的大小为0.5cm2。
15.进一步地，步骤(2)中所述接种于加富pda培养基后黑暗条件下培养的条件为24℃恒温培养7～9d；所述接种于综合pda培养基后黑暗条件下培养的条件为24℃恒温培养10～12d。
16.进一步地，步骤(3)中所述液体培养基中各原料浓度为：蔗糖8～12g/l，玉米浆浸膏5～10g/l，酵母粉3～7g/l，玉米淀粉3～5g/l，磷酸二氢钾1～2g/l，硫酸镁1～2g/l，维生素5～10mg/l。
17.进一步地，步骤(3)中所述高压蒸汽灭菌是指在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min。
18.进一步地，步骤(4)中所述纯化母种菌块大小为0.5cm2。
19.进一步地，步骤(4)中所述接种至液体培养基中培养的条件为：24℃恒温培养箱中静置24h，然后转入恒温振荡器中培养，调节转速为140～150r/min，温度为23～25℃，培养12～16d。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.(1)本发明采用的液体菌种菌龄较一致、生长速度快、菌丝渗透性强，污染率低，大大缩短了白肉灵芝生产用种及生产菇包的培养时间，其中液体菌种较固体菌种培养时间缩短13～18天，接种的菌包培养时间缩短了5～10天，杂菌感染率降低了3％～9％，生产成本也大幅度降低。
22.(2)本发明采用的白肉灵芝母种制作方式明显提升了白肉灵芝母种的菌种活力及纯度，为后续的液体菌种生产提供了优良菌种。
23.(3)本发明获得的特定比例的培养基原料，为白肉灵芝液体菌种的生长提供最佳的营养条件，其中氮源玉米浆选择浸膏剂更利于菌种的吸收利用，其效果较粉剂更佳，菌球数量及干重均有所提升，培养时间缩短3～4天左右，有效提高了生产效率。
24.(4)白肉灵芝是近年来的灵芝新品种，在多糖、三萜等活性物质的种类及含量上均较赤芝具有显著优势，为目前市售灵芝中价格最高的品种，具有巨大的开发潜力，目前白肉灵芝的规模化栽培中采用的菌种制作方式仍以固体菌种为多，本发明提供的白肉灵芝液体菌种制作方式可以有效提高菌种质量，提升生产效率，降低生产成本，操作简单可控且易推向规模化生产。
附图说明
25.图1为实施例1～5的液体菌种培养情况图；
26.图2为实施例6中接种不同类型菌种的生长情况图；
27.图3为实施例7中在不同蛋白胨添加量的加富pda培养基上白肉灵芝的菌丝生长情况图；
28.图4为实施例8中制种过程不改变培养基情况下白肉灵芝菌丝的生长情况及与实施例3在纯化过程中变更培养基(采用综合pda培养基)情况下白肉灵芝菌丝的生长情况对
比图；
29.图5为实施例9在不同取种位置的白肉灵芝菌丝生长情况对比图。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
31.实施例1
32.(1)菌种制备及纯化：配置综合pda培养基(原料由20g/l土豆(煮汁过滤)、20g/l葡萄糖、20g/l琼脂、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁组成)、加富pda培养基(原料由20g/l土豆(煮汁过滤)、20g/l葡萄糖、20g/l琼脂、3g/l磷酸二氢钾、1.5g/l硫酸镁、8g/l蛋白胨组成)，制作斜面培养基(试管20mm
×
200mm)，挑取0.5cm2白肉灵芝幼嫩子实体组织块于加富pda斜面培养基上，黑暗条件下，24℃恒温培养8d，挑选距离组织块2cm外的菌种块接入综合pda斜面培养基上，黑暗条件下，24℃恒温培养10d，备用。
33.(2)液体培养基配制：按液体种培养基配方，蔗糖15g/l，玉米浆浸膏8g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.75g/l，维生素10mg/l，加水溶解定容至1l，调节ph值为5.0。准备500ml容量的三角瓶，每瓶分装200ml的液体培养基，盖上硅胶塞，用封口膜包裹瓶口，放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，冷却备用。
34.(3)接种及培养：取纯化后的白肉灵芝母种一支，挑取距离接种点2cm外的4块0.5cm2母种菌块接入三角瓶中，24℃恒温培养箱中静置24h，24h后转入恒温振荡器中培养，调节转速为150r/min，温度为23～25℃。
35.实施例2
36.(1)菌种制备及纯化：同实施例1。
37.(2)液体培养基配制：按液体种培养基配方，蔗糖15g/l，玉米浆浸膏8g/l，酵母粉5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.75g/l，维生素10mg/l，加水溶解定容至1l，调节ph值为5.0。准备500ml容量的三角瓶，每瓶分装200ml的液体培养基，盖上硅胶塞，用封口膜包裹瓶口，放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，冷却备用。
38.(3)接种及培养：同实施例1。
39.实施例3
40.(1)菌种制备及纯化：同实施例1。
41.(2)液体培养基配制：按液体种培养基配方，蔗糖10g/l，玉米浆浸膏8g/l，酵母粉5g/l，玉米淀粉5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.75g/l，维生素10mg/l，加水溶解定容至1l，调节ph值为5.0。准备500ml容量的三角瓶，每瓶分装200ml的液体培养基，盖上硅胶塞，用封口膜包裹瓶口，放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，冷却备用。
42.(3)接种及培养：同实施例1。
43.实施例4
44.(1)菌种制备及纯化：同实施例1。
45.(2)液体培养基配制：按液体种培养基配方，蔗糖10g/l，玉米浆浸膏10g/l，酵母粉8g/l，玉米淀粉5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.75g/l，维生素10mg/l，加水溶解定容至1l，调节ph值为5.0。准备500ml容量的三角瓶，每瓶分装200ml的液体培养基，盖上硅胶塞，用封口膜包裹瓶口，放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，冷却备用。
46.(3)接种及培养：同实施例1。
47.实施例5
48.(1)菌种制备及纯化：同实施例1。
49.(2)液体培养基配制：按液体种培养基配方，蔗糖10g/l，玉米浆干粉8g/l，酵母粉5g/l，玉米淀粉5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.75g/l，维生素10mg/l，加水溶解定容至1l，调节ph值为5.0。准备500ml容量的三角瓶，每瓶分装200ml的液体培养基，盖上硅胶塞，用封口膜包裹瓶口，放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，冷却备用。
50.(3)接种及培养：同实施例1。
51.对实施例1～5的液体菌种培养情况进行统计，结果如表1和图1所示：
52.表1不同实施例的液体菌种培养情况
[0053][0054]
由上述结果可见，5个实施例中白肉灵芝的菌丝均能在液体培养基中生长，并长出分枝纵横交错相互缠绕形成菌球。实施例1和实施例2培养液清澈，培养完成后上层为菌液，下层为菌球，菌球直径较大，且间液清澈。实施例3和实施例4添加玉米淀粉培养液浑浊粘度大，培养完成后有大量菌球悬浮，菌球分布均匀，直径小，菌球间液清澈。
[0055]
实施例6
[0056]
(1)菌种制备及纯化：同实施例1。
[0057]
(2)固体培养基配制：按质量百分比计为棉籽壳31％，木屑58％，麦麸10％，碳酸钙1％的原料组成，含水量62％-65％，配制固体菌种培养基。将栽培料装入17cm
×
35cm的聚丙烯栽培袋中，121℃高压蒸汽灭菌2h，冷却后备用。
[0058]
(3)液体培养基配制：按实施例3的方案制作液体菌种培养基。
[0059]
(4)固体菌种及液体菌种的接种及培养：两种不同类型菌种的接种方式同实施例1，固体菌种接种后放入25℃发菌房进行黑暗培养，液体菌种接种后放入24℃恒温培养箱中静置24h。24h后转入恒温振荡器中培养，调节转速为150r/min，温度为23～25℃。
[0060]
(5)生产菌包的接种及培养：按质量百分比计为棉籽壳24％，木屑65％，麦麸10％，碳酸钙1％的原料组成，含水量62％-65％，配制生产菌包培养基。将栽培料装入17cm
×
35cm的聚丙烯栽培袋中，121℃高压蒸汽灭菌2h，冷却后分别接种完成培养的固体菌种和液体菌
种，接种完成后放入25℃发菌房进行黑暗培养。
[0061]
本实施例的菌丝生长情况如表2和图2(左为接种固体菌种，右为接种液体菌种)所示：
[0062]
表2不同类型白肉灵芝菌种的生长情况及菌种活力情况
[0063][0064]
由上述结果可知，采用本发明液体菌种培养相比固体菌种，大大缩短了白肉灵芝生产用种及生产菇包的培养时间，其中液体菌种较固体菌种培养时间缩短13～18天，接种的菌包培养时间缩短了5～10天，杂菌感染率降低了3％～9％，生产成本也大幅度降低。
[0065]
实施例7
[0066]
(1)菌种制备及纯化：采用浓度分别为5g/l、8g/l、10g/l蛋白胨添加量的加富pda培养基培养，其余同实施例3。
[0067]
(2)液体培养基配制：同实施例3。
[0068]
(3)接种及培养：同实施例3。
[0069]
本实施例在不同蛋白胨添加量的加富pda培养基上白肉灵芝的菌丝生长情况如图3所示(从左到右添加浓度分别为5g/l、8g/l、10g/l，上图为生长7天，下图为生长14天)。
[0070]
由图3结果可见，添加适量蛋白胨可明显促进白肉灵芝菌种生长。
[0071]
实施例8
[0072]
(1)菌种制备及纯化：制种过程不改变培养基，挑取0.5cm2白肉灵芝幼嫩子实体组织块于加富pda斜面培养基上，黑暗条件下，24℃恒温培养18d。
[0073]
(2)液体培养基配制：同实施例3。
[0074]
(3)接种及培养：同实施例3。
[0075]
本实施例制种过程不改变培养基情况下白肉灵芝菌丝的生长情况及与实施例3在纯化过程中变更培养基(采用综合pda培养基)情况下白肉灵芝菌丝的生长情况对比如图4所示(左图为本实施例制种过程不改变培养基，右图为实施例3采用的纯化过程中变更培养基)。
[0076]
由图4结果可见，白肉灵芝母种的制备采用加富pda培养基及纯化采用营养减少的综合pda培养基的方式进行培养，有利于白肉灵芝菌丝的生长。
[0077]
实施例9
[0078]
(1)菌种制备及纯化：在距离接种块2cm之内取菌种块接入综合pda斜面培养基上培养。
[0079]
(2)液体培养基配制：同实施例3。
[0080]
(3)接种及培养：同实施例3。
[0081]
本实施例在距离接种块2cm之内取菌种培养及与实施例3在距离接种块2cm之外取菌种培养的白肉灵芝菌丝生长情况对比图如图5所示(左图为在距离接种块2cm之内取菌种，右图为在距离接种块2cm之外取菌种)。
[0082]
由图5结果可见，接种菌种块的选取位置的选定，关系到所选菌种块菌丝的生长活
力，在菌丝纯化时选择距离接种块2cm以外的位置，既可保证菌种的活力又缩短了菌种培养的时间。
[0083]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。