一种用于醉鱼草属植物组培快繁的培养基组合及其应用

1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于醉鱼草属植物组培快繁的培养基组合及其应用。


背景技术：

2.腺叶醉鱼草(buddleja delavayi)隶属于玄参科，醉鱼草属，为我国特有植物。其为1～6米高灌木或小乔木，产于云南宾川、泸西和西藏墨脱、林芝等地2000-3000米海拔的山地疏林或山坡灌木丛中，圆锥状聚伞花序顶生或腋生，具有较好的园林观赏价值。
3.由于腺叶醉鱼草野外分布区域狭窄，种群数量较少，是一种典型的极小种群野生植物，加之种子较小，采集困难，组培方法扩大繁殖与保护意义重大。2017年被列入《中国高等植物受威胁物种名录》易危vu种类。然而，迄今为止并没有关于腺叶醉鱼草组培快繁和相关的生物技术方面的报道，因此，迫切需要一种针对腺叶醉鱼草的组培快繁方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于醉鱼草属植物组培快繁的培养基组合及其应用，所述培养基组合简化了醉鱼草属植物组织培养的培养基种类和步骤，实现了醉鱼草属植物的快速繁殖，解决了腺叶醉鱼草野外分布零星、种群数量稀少和濒临绝灭的问题。
5.本发明提供了一种用于醉鱼草属植物组培快繁的培养基组合，所述培养基组合包括诱导分化培养基、增殖继代培养基和壮苗生根培养基；
6.所述诱导分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.1～0.5mg/l、iaa 0.1～1.0mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4；
7.所述增殖继代培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.1～0.5mg/l、iaa 0.1～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4；
8.所述壮苗生根培养基以ms培养基为基础培养基，还包括iaa 0.1～0.5mg/l、iba 0.1～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4。
9.优选的，所述诱导分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.2～0.5mg/l、iaa 0.5～1.0mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4；
10.所述增殖继代培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.2～0.5mg/l、iaa 0.2～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4；
11.所述壮苗生根培养基以ms培养基为基础培养基，还包括iaa 0.2～0.5mg/l、iba 0.2～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4。
12.优选的，所述诱导分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.2mg/l、iaa 0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.0g/l，ph为6.0；
13.所述增殖继代培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.2mg/l、iaa 0.2mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.0g/l，ph为6.0；
14.所述壮苗生根培养基以ms培养基为基础培养基，还包括iaa 0.2mg/l、iba 0.2mg/
l、蔗糖30g/l和琼脂5.0g/l，ph为6.0。
15.优选的，所述培养基组合还包括移栽培养基，所述移栽培养基包括珍珠岩、腐殖土和生红木；所述珍珠岩、腐殖土和生红木的体积比为(1～2)：(1～2)：(1～3)。
16.本发明还提供了上述技术方案所述的培养基组合在醉鱼草属植物组培中的应用。
17.优选的，所述醉鱼草属植物包括腺叶醉鱼草。
18.本发明提供了一种腺叶醉鱼草组培快繁的方法，采用上述技术方案所述的培养基组合对腺叶醉鱼草进行培养，得到腺叶醉鱼草无菌生根苗。
19.优选的，包括如下步骤：将消毒的腺叶醉鱼草外植体于诱导分化培养基中进行第一培养，得到侧芽和不定芽；
20.将所述侧芽和不定芽于增殖继代培养基中进行第二培养，得到无根丛苗；
21.将所述无根丛苗于壮苗生根培养基中进行第三培养，得到腺叶醉鱼草无菌生根苗。
22.优选的，所述第一培养的温度为23～25℃，光照强度为1500～2000lux，光照周期为(10～12)l：(12～14)d，培养时间为45～60d；
23.所述第二培养的温度为23～25℃，光照强度为1500～2000lux，光照周期为(10～12)l：(12～14)d，培养时间为45～60d；
24.所述第三培养的温度为23～25℃，光照强度为1500～2000lux，光照周期为(10～12)l：(12～14)d，培养时间为30～45d。
25.优选的，还包括将所述腺叶醉鱼草无菌生根苗于移栽基质中进行第四培养，得到腺叶醉鱼草种苗；
26.所述第四培养的温度为23～25℃，空气相对湿度为70％～80％，基质相对湿度为50％～60％。
27.有益效果：
28.本发明提供了一种用于醉鱼草属植物组培快繁的培养基组合，包括诱导分化培养基、增殖继代培养基和壮苗生根培养基，所述培养基组合将诱导与分化培养基合二为一、增殖与继代培养基合二为一，壮苗与生根培养基合二为一，在保障诱导与分化、增殖与继代、壮苗与生根效果最佳的状态的基础上，将各步骤的培养基合二为一，既简便组培程序，又降低了生产成本简化了醉鱼草属植物的培养基类型和组织培养的步骤，实现了醉鱼草属植物的快速繁殖，可在短时间内得到醉鱼草属植物种苗。
29.同时，本发明还提供了培养基组合在醉鱼草属植物组培组培中的应用，将所述培养基组合应用到醉鱼草属植物的组织培养中，诱导分化率和生根率高，繁殖周期仅为45～60d，极大地提高了腺叶醉鱼草的繁殖速率。同时可以解决包括腺叶醉鱼草在内的醉鱼草属植物野外分布零星、种群数量稀少、濒临绝灭的问题；高度保持了腺叶醉鱼草的遗传稳定性和一致性；为该物种的保护与繁育、引种驯化、保存和规模化生产供了技术支撑，填补了醉鱼草属植物在生物技术上的研发空白。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
31.图1为实施例1中腺叶醉鱼草的腋芽和不定芽；
32.图2为实施例2中腺叶醉鱼草的无根丛苗；
33.图3为实施例3中腺叶醉鱼草的无菌生根苗。
具体实施方式
34.本发明提供了一种用于醉鱼草属植物组培快繁的培养基组合，所述培养基组合包括诱导分化培养基、增殖继代培养基和壮苗生根培养基；所述诱导分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.1～0.5mg/l、iaa 0.1～1.0mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4；所述增殖继代培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.1～0.5mg/l、iaa 0.1～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4；所述壮苗生根培养基以ms培养基为基础培养基，还包括iaa 0.1～0.5mg/l、iba 0.1～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l，ph为5.8～6.4。
35.本发明所述诱导分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.1～0.5mg/l、iaa 0.1～1.0mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l。本发明所述诱导分化培养基中的6-ba的浓度为0.1～0.5mg/l，优选为0.2～0.5mg/l，更优选为0.2mg/l；所述iaa的浓度为0.1～1.0mg/l，优选为0.5～1.0mg/l，更优选为0.5mg/l；所述蔗糖的浓度为30g/l；所述琼脂的浓度为5.5～6.0g/l，优选为5.0g/l。本发明所述诱导分化培养基的ph为5.8～6.4，优选为6.0。本发明所述诱导分化培养基中的激素组合及含量可实现醉鱼草属植物一步诱导不定芽，将诱导培养基和分化培养基合二为一，简化了操作步骤，且诱导不定芽的效果良好，不定芽诱导率和诱导的不定芽的平均数量均显著提高。
36.本发明所述诱导分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-ba 0.1～0.5mg/l、iaa 0.1～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l。本发明所述诱导分化培养基中的6-ba的浓度为0.1～0.5mg/l，优选为0.2～0.5mg/l，更优选为0.2mg/l；所述iaa的浓度为0.1～0.5mg/l，优选为0.2～0.5mg/l，更优选为0.2mg/l；所述蔗糖的浓度为30g/l；所述琼脂的浓度为5.5～6.0g/l，优选为5.0g/l。本发明所述诱导分化培养基的ph为5.8～6.4，优选为6.0。本发明所述增殖继代培养基中特定的激素组合及含量可以实现醉鱼草属植物增殖与继代培养合二为一，简化操作步骤，所获得的无根从苗无玻璃苗产生，繁殖倍数较高。
37.本发明所述壮苗生根培养基以ms培养基为基础培养基，还包括iaa 0.1～0.5mg/l、iba 0.1～0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂5.5～6.0g/l。本发明所述壮苗生根培养基中的6-ba的浓度为0.1～0.5mg/l，优选为0.2～0.5mg/l，更优选为0.2mg/l；所述iaa的浓度为0.1～0.5mg/l，优选为0.2～0.5mg/l，更优选为0.2mg/l；所述蔗糖的浓度为30g/l；所述琼脂的浓度为5.5～6.0g/l，优选为5.0g/l。本发明所述诱导分化培养基的ph为5.8～6.4，优选为6.0。本发明所述壮苗生根培养基中特定的激素组合和含量可实现醉鱼草属植物壮苗和生根培养合二为一，简化操作步骤，且生根和壮苗效果良好，生根率可达100％。
38.本发明所述培养基组合优选还包括移栽培养基，所述移栽培养基优选包括珍珠岩、腐殖土和生红木；所述珍珠岩、腐殖土和生红木的体积比优选为(1～2)：(1～2)：(1～3)，更优选为1：2：3。本发明特定的珍珠岩、腐殖土、生红土三种基质比例，增加了基质疏松度和根部透气性，也为根部提供了足够的营养；同时红土为土层深部土壤，带菌量较少，有利于无菌苗的生长，使用本发明的移栽培养基，腺叶醉鱼草的移栽成活率可达到95％。
39.本发明提供的培养基组合将诱导与分化培养基合二为一，增殖与继代培养基合二为一，壮苗与生根培养基合二为一，简化了醉鱼草属植物组织培养的操作步骤，成苗容易，有效繁殖率高，实现了醉鱼草属植物的快速繁殖，解决了醉鱼草属植物野外分布零星、种群数量稀少、濒临绝灭的问题，为醉鱼草属植物全面的保护、开发和持续利用、种质资源保存奠定了基础，填补了醉鱼草属植物在生物技术上的研发空白。
40.本发明还提供了上述技术方案所述的培养基组合在醉鱼草属植物组培中的应用。本发明所述醉鱼草属植物优选包括腺叶醉鱼草。本发明将所述培养基组合对包括腺叶醉鱼草在内的醉鱼草属植物进行组织快繁培养，极大地提高了腺叶醉鱼草的繁殖数量与生长速率，为该物种的保护与繁育、引种驯化、保存和规模化生产提供了技术支撑。
41.本发明提供了一种腺叶醉鱼草组培快繁的方法，采用上述技术方案所述的培养基组合对腺叶醉鱼草进行培养，得到腺叶醉鱼草无菌生根苗。
42.本发明将消毒的腺叶醉鱼草外植体于诱导分化培养基中进行第一培养，得到侧芽和不定芽。本发明所述外植体的大小优选为1cm的带节小茎段。
43.本发明所述腺叶醉鱼草外植体优选包括腺叶醉鱼草的顶芽和/或侧芽，进一步优选为顶芽；所述顶芽和侧芽优选为幼嫩的顶芽和侧芽。本发明所述腺叶醉鱼草外植体的消毒方法优选包括如下步骤：以体积百分含量为10％的外植体消毒液对腺叶醉鱼草外植体浸泡3～5min，以过滤水冲洗浸泡后的腺叶醉鱼草外植体，得到干净的腺叶醉鱼草外植体；以体积浓度为75％的酒精溶液和质量浓度为0.1％的升汞对所述干净的腺叶醉鱼草外植体依次进行消毒处理，无菌水冲洗3～5次，得到消毒的腺叶醉鱼草外植体。本发明对所述外植体消毒液的来源没有特殊限定，采用本领域常规外植体消毒液即可，如万金牌消毒液。本发明优选以过滤水对浸泡后的腺叶醉鱼草外植体冲洗3次。在本发明中，所述酒精溶液的消毒处理时间优选为10s，所述升汞的处理时间优选为5～7min，更优选为6min。本发明在以质量浓度为75％的酒精溶液对所述干净的腺叶醉鱼草外植体消毒处理后，优选还包括用无菌水冲洗3次。采用本发明所述的的消毒方法可使腺叶醉鱼草外植体的无菌率达到80％以上。
44.得到所述消毒的腺叶醉鱼草外植体后，本发明将消毒的腺叶醉鱼草外植体于诱导分化培养基中进行第一培养，得到侧芽和不定芽。本发明优选将所述消毒的腺叶醉鱼草外植体平放在所述诱导分化培养基中。当所述外植体为顶芽或腋芽时，所述消毒的腺叶醉鱼草外植体的接种量优选为3～5个顶芽或腋芽/100cm2，进一步优选为3个顶芽或腋芽/100cm2；本发明所述第一培养的温度优选为23～25℃，进一步优选为25℃；光照强度优选为1500～2000lux，进一步优选为1600-1800lux，更优选为1800lux；光照周期优选为(10～12)l：(12～14)d，进一步优选为(11～12)l：(12～13)d，更优选为12l：12d；时间优选为45～60d，进一步优选为50～55d；更优选为50d。在本发明特定的诱导与分化培养条件下，腺叶醉鱼草诱导和分化侧芽长势良好。
45.得到所述侧芽后，本发明将所述侧芽转接于增殖继代培养基中进行第二培养，得到无根小苗。本发明所述第二培养的温度优选为23～25℃，进一步优选为24～25℃；光照强度优选为1500～2000lux，进一步优选为1600～1800lux，更优选为1800lux；光照周期优选为(10～12)l：(12～14)d；进一步优选为(11～12)l：(12～13)d，更优选为12l：12d；时间优选为40～60d，进一步优选为45～60d，更优选为50d。在本发明特定的增殖继代培养基及培养条件下，腺叶醉鱼草的无根小苗长势良好。
46.得到所述无根小苗后，本发明将所述无根丛苗于壮苗生根培养基中进行第三培养，得到腺叶醉鱼草无菌生根苗。本发明所述第三培养的温度优选为23～25℃，进一步优选为24～25℃；光照强度优选为1500～2000lux，进一步优选为1600～1800lux，更优选为1800lux；光照周期优选为(10～12)l：(12～14)d；进一步优选为(11～12)l：(12～13)d，更优选为12l：12d；时间优选为30～45d，进一步优选为30～40d，更优选为35d。在本发明特定的壮苗生根培养条件下，腺叶醉鱼草生根率100％，长势良好。
47.得到所述腺叶醉鱼草无菌生根苗后，本发明优选将所述腺叶醉鱼草无菌生根苗进行炼苗。本发明优选在大棚中进行炼苗。在本发明中，所述炼苗的遮光率优选为70～85％，进一步优选为75～80％，更优选为75％；温度优选为23～25℃；更进一步优选为24℃；空气相对湿度优选为40％～50％，进一步优选为40％～45％；更优选为45％；时间优选为7～10d，进一步优选为7～8d，更优选为8d。经过本发明所述炼苗后可提高腺叶醉鱼草的移栽成活率。
48.完成所述炼苗后，本发明优选将炼苗后的腺叶醉鱼草无菌生根苗移栽至移栽基质中进行第四培养，得到腺叶醉鱼草种苗。进行所述移栽前，本发明优选以800～1000倍多菌灵对所述移栽基质进行喷施后，完成消毒。完成所述消毒后，本发明优选还包括调节所述移栽基质的ph至6.2～6.4，而后进行移栽。本发明所述第四培养的温度优选为23～25℃，进一步优选为24～25℃；基质湿度优选为50％～60％，进一步优选为50％～55％，更优选为55％；空气相对湿度优选为70％～80％，进一步优选为70％～75％，更优选为75％。本发明特定的移栽条件保障了移栽的腺叶醉鱼草生根苗的高成活率，可达95％。
49.采用本发明提供的腺叶醉鱼草组培快繁方法，腺叶醉鱼草的诱导分化和生根率均较高，繁殖周期仅为45～60d，极大地提高了腺叶醉鱼草的繁殖速率，为该物种的保护与繁育、引种驯化、保存和规模化生产供了技术支撑。
50.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
51.实施例1
52.诱导分化培养基筛选
53.取腺叶醉鱼草的幼嫩顶芽或侧芽为外植体，用5％的万金喷雾消毒液浸泡3-5min，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，去叶，剪成1cm大小的带节小茎段，用75％的酒精消毒5～10s，无菌水冲洗3遍后，再用0.1％升汞溶液消毒5～6min，无菌水清洗3～5次，接种于准备好的诱导培养基中，每瓶插1个芽节；
54.将茎段分别接种在组分为ms+0.1～0.5mg/l 6-ba+0.1～1.0mg/l iaa范围内的培养基上，其培养基中还包括蔗糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.8。光强度为1000-2000lux，温度为23-30℃，光照时间8-10小时。
55.统计结果见表1。
56.表1腺叶醉鱼草诱导培养基筛选
[0057][0058]
备注：表中
“‑”
表示无愈伤组织；“+”表示少量愈伤组织“++”表示较多愈伤组织。
[0059]
由表1的结果可知，腺叶醉鱼草侧芽诱导在ms+0.1～0.5mg/l6-ba+0.1～1.0mg/l iaa培养基上，诱导率达到40％～60％；其中ms+0.2mg/l6-ba+0.5mg/l iaa的诱导效果最好，诱导情况见图1。本发明优先选择愈伤组织小且侧芽或顶芽诱导率高的组分作为诱导分化培养基。
[0060]
实施例2
[0061]
增殖继代培养基筛选
[0062]
以ms培养基为增殖继代培养基，以实施例1中ms+0.2mg/l 6-ba+0.5mg/l iaa得到的侧芽为植物材料筛选基本培养基，其中细胞分裂素6-ba设置3个梯度，分别为0.1mg/l，0.2mg/l和0.5mg/l；生长素iaa设置3个梯度，分别为0.1mg/l，0.2mg/l和0.5mg/l，采用均匀设计法进行，筛选合适的增殖继代培养基。上述各增值继代培养基中还含有蔗糖30g/l，琼脂5.5g/l，ph5.8。增殖与继代培养的条件为：光强度为1800lux，温度为25℃，光照周期为10l：24d，培养周期为50d。统计结果见表2。
[0063]
表2增殖培养基激素筛选
[0064][0065]
备注：表中
“‑”
表示无愈伤组织；“+”表示少量愈伤组织；“++”表示较多愈伤组织。
[0066]
增殖系数＝有效芽的芽数/接种芽数；
[0067]
由表2可以看出，在ms培养基+0.1～0.5mg/l 6-ba(6-苄基嘌呤)+0.1～0.5mg/l iaa，蔗糖30g/l+琼脂5.5g/l，ph5.8，培养周期45-60天，光强度为1800lux，温度为23～25℃的平均有效芽节数量(包含顶芽)为3～6，增殖系数为3～6，无玻璃苗，生长速度较快，株高
达5-7.0cm，茎粗1～2mm。见图2。
[0068]
实施例3
[0069]
壮苗生根培养基筛选
[0070]
以ms培养基为壮苗与生根培养基激素筛选的基本培养基，以实施例2中ms+0.2mg/l 6-ba+0.2mg/l iaa组合得到的有效芽节和丛芽为研究对象，筛选壮苗生根培养基。生长素iaa设置3个梯度，分别为0.1mg/l，0.2mg/l和0.5mg/l，iba设置3个梯度，分别为0.1mg/l，0.2mg/l和0.5mg/l，筛选合适的壮苗生根培养基。上述各壮苗生根培养基中还含有蔗糖30g/l，琼脂5g/l，ph6.0。壮苗与生根培养的条件为：光强度为1800lux，温度为23～25℃，光照周期为10l：14d，培养周期为30d。壮苗与生根培养30d的统计结果见表3。
[0071]
表3生根培养基激素筛选结果
[0072][0073]
备注：表中
“‑”
表示无愈伤组织；“+”表示少量愈伤组织“++”表示较多愈伤组织；
[0074]
结果表明：在ms培养基+0.1～0.5mg/l iaa(吲哚乙酸)、ms培养基+0.1～0.5mg/l iba(吲哚丁酸)和ms培养基+0.1-0.5mg/l iaa(吲哚乙酸)+0.1～0.5mg/l iba(吲哚丁酸，蔗糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.8～6.4，培养周期30天，生根率达100％，在ms+0.2mg/l iaa+0.2mg/l iba中植株生长明显较快，根数较多，并且根部没有愈伤组织。见图3。
[0075]
实施例4
[0076]
移栽培养基筛选
[0077]
将实施例3中ms+0.5mg/l 6-ba+1.0mg/l naa培养基得到的腺叶醉鱼草生根无菌苗提前一周移至遮光率为75％～85％的大棚炼苗。将炼苗后的生根无菌苗移栽到不同的移栽培养基中，筛选合适的移栽培养基。本试验移栽培养基分别为：生红土、珍珠岩、腐殖土/生红土混合基质、珍珠岩/腐殖土/生红土混合基质，其中，腐殖土/生红土混合基质中腐殖土和生红土的体积比为1：1，珍珠岩/腐殖土/生红土混合基质中珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为：1：2：3。上述移栽培养基用800～1000倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7d，调节ph至6.2～6.4后再进行移栽。移栽后及时喷水并覆盖塑料膜，大棚温度为24～25℃，基质湿度40～50％。每个处理移栽的数量为20株，重复3次试验。移栽30d后，统计各处理的移栽成活率。检测结果见表4。
[0078]
表4移栽培养基的筛选
[0079][0080]
由表4的结果可知，珍珠岩、腐殖土和生红土的混合基质移栽成活率最高，移栽30d后的成活率达到95％；同时移栽后的腺叶醉鱼草开花后的形状与母本保持一致，进而说明采用本发明提供的培养基组合和方法高度保持了腺叶醉鱼草的遗传稳定性和一致性。
[0081]
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的培养基组合可以在短时内得到腺叶醉鱼草种苗，45-60天诱导分化率60％，在45-60天增殖系数为6，生根率为100％，移栽成活率为95％，极大地提高了腺叶醉鱼草的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林园艺及其商业、科研价值的发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。
[0082]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。