大规模工业化多细胞动物发酵培养方法与流程

本发明属于，具体涉及一种用大型发酵罐对真核多细胞动物进行大规模发酵培养的方法。

背景技术：

1、秀丽隐杆线虫是定细胞线虫纲生物，由咽食、排泄和生殖系统组成，具有结构简单、细胞定数、个体小、发育迅速、生活周期短等特点。秀丽隐杆线虫的生命周期约18-22天，从卵发育为成虫仅需3-5天，并且它也大多是自体受精的雌雄同体。秀丽隐杆线虫是一种非寄生的线虫，主要以细菌为食物，具有实验安全性，每条成虫约产300个卵，可在实验室中短时间大批量产生，实验所用的线虫可在含有大肠杆菌的固体培养基或液体培养基中大量培养。固体培养是在附有线虫食物的琼脂平板上，于20℃全恒温生化培养箱中倒置培养；线虫的液体培养也仅局限于锥形瓶中，由于条件有限，获得所需线虫的量也极为有限。

2、目前工业发酵培养工艺有很多局限：1.仅用于细菌类、酵母类、工具细胞等单细胞体系培养；2.通过遗传学手段改造过后的上述培养对象，由于是单细胞低等生物或者是细胞，很多情况下很难满足发酵产物的生物学活性，例如发酵产物是蛋白质，会存在蛋白质折叠错误而没有活性，因此有发酵后的产物活性很低等问题；3. 多细胞动物是一个整体，具有完整的各个生理系统，非常有利于产物活性的产生和维持，但是目前没有涉及多细胞动物的发酵培养技术。

3、模式动物线虫是实验室常用的多细胞动物，结构虽然简单但是神经系统、消化系统、免疫系统等功能与哺乳动物很类似，但是由于技术难关没有突破，目前线虫的培养只限于固态培养基ngm培养和小体积的液体培养，这两种培养方法都无法实现作为一个工业化生产发酵产物的方式。

技术实现思路

1、为了解决以上技术不足，我们发明了一种大规模多细胞动物发酵培养技术。这一发明从根本上解决单细胞发酵体系带来的一系列问题，本发明以发酵产物为蛋白为例子，多细胞动物线虫发酵培养后能纯化出具有生物活性的蛋白质复合物；同时我们对发酵罐进行升级，连接了低温水循环系统，稳定控制发酵罐内的温度，方便调节温度至线虫生长最适温度20~25℃，建立了适合线虫生长的发酵体系，从技术上突破了工业化大规模发酵培养多细胞动物线虫的工艺，打破了实验室固体培养基和小体积液体培养的瓶颈。

2、第一：线虫食物大肠杆菌op50的准备，在开始发酵罐培养线虫的前2天，应准备好所需的线虫食物

3、1.1）将单个大肠杆菌菌落接种到300~500ml 细菌液体培养基中，37℃摇床过夜培养。

4、1.2）次日，将摇好的菌液放置4℃保存，同时取出20μl左右滴加在干净的琼脂平板上，验证是否会长杂菌。

5、1.3）称取500g nacl，500g胰蛋白胨，250g酵母粉加水至50l，配制50l体积的细菌液体培养基，于发酵罐中灭菌（灭菌前加入0.1%~1%比例的消泡剂），灭菌操作如下：

6、1.3.1）打开蒸发器（蒸发器进水阀为开启状态），其压力表升至0.4mpa时缓慢打开蒸汽总阀。

7、1.3.2）打开放空阀、自来水进、自来水出和排污阀，其他阀门为关闭状态。

8、1.3.3）控制面板上开启自动灭菌功能（设置好温度120℃及时间20min）。

9、1.3.4）温度升至80℃时，排污阀关小。

10、1.3.5）温度升至100℃时，放空阀关小。

11、1.3.6）温度升至110℃时，进行管道灭菌：打开针形阀，半开蒸汽阀，缓慢打开隔膜阀，确保过滤器压力（不超过0.2mpa）高于罐体压力（0.05~0.1mpa）。

12、1.3.7）灭菌结束时，打开空气流量测定（手动或自动，只开其中一个），关闭隔膜阀和蒸汽阀（先），打开空气阀（后），几分钟后关闭针形阀。

13、1.3.8）冷却：关闭排污阀，打开冷却阀。冷却过程中要打开隔膜阀补气，确保罐内压力为正（0.05~0.1mpa）。控制面板上，温度控制程序改为自动。先用自来水降温至40℃左右，再开启冷水降温系统。

14、1.3.9）接种：当罐内温度降至37℃后，使用放空阀将罐内压力将至0.05mpa，慢慢拧松接种口，在接种口附近塞上沾有酒精的棉花，拧开接种口的瞬间点燃火焰，将验证好的op50接种到发酵罐中，拧紧接种口旋钮，并利用放空阀恢复罐内压力至0.05~0.1mpa。

15、1.4）37℃，120rpm发酵过夜。

16、1.5）次日，对发酵罐出料口进行灭菌操作：打开蒸发器（蒸发器进水阀为开启状态），其压力表升至0.4mpa时缓慢打开蒸汽总阀。再打开取样灭菌阀和出料阀，待出料口冒出蒸汽，即为灭菌结束。先关闭取样灭菌阀，再关闭蒸发器。

17、1.6）将菌液从发酵罐出料口取出，取出20μl左右滴加在干净的琼脂平板上，验证是否会长杂菌。

18、1.7）离心获得菌体沉淀，4℃保存备用。

19、1.8）清洗发酵罐：先用清水冲洗，再进行灭菌操作。

20、第二：用50~100l线虫液体培养基规模培养线虫，大概需要发酵100~120l线虫食物菌液。

21、线虫的准备

22、2.1）用10-12个90mm 附有线虫食物的琼脂平板培养线虫。

23、2.2）养至绝大部分线虫处于成虫第1~2天阶段，用裂解液裂解取卵，转至2-3个6孔板中进行液体震荡培养。

24、2.3）在6孔板中养至成虫第1~2天阶段，用裂解液裂解取卵，转至1个含有500~800ml线虫液体培养基的锥形瓶中震荡培养。

25、2.4）在锥形瓶中养至成虫第1~2天阶段。

26、第三，50~100l发酵罐大规模培养线虫

27、准备50~100l线虫液体培养基s- medium所需的成分：

28、nacl 0.5%~0.6%，edta 0.15%~0.2%，k2po4 0.55%~0.65%，kh2po4 0.8%~0.12%，0.22‰~0.28‰胆固醇（无水乙醇配），0.14~0.15‰ cacl2 ，0.12~0.14‰mgso4 ，0.65~0.7‰feso4.7h2o，0.18~0.22‰mncl2.4h2o，0.25~0.3‰znso4.7h2o，0.022~0.028‰cuso4.5h2o。

29、3.1）校准发酵罐的ph电极和溶氧电极。

30、3.2）称取nacl， edta， k2po4和kh2po4于发酵罐中，加水至50l，再加入0.1%~1%比例的消泡剂，于发酵罐中灭菌，灭菌操作同上。

31、3.3）当罐内温度降至低于50℃后，使用放空阀将罐内压力将至0~0.05mpa，慢慢拧松接种口，在接种口附近塞上沾有酒精的棉花，拧开接种口的瞬间点燃火焰，加入已除菌的cacl2和 mgso4，再加入已过滤除菌的0.65~0.7‰feso4.7h2o，0.18~0.22‰mncl2.4h2o，0.25~0.3‰znso4.7h2o，0.022~0.028‰cuso4.5h2o，熄灭火圈，加入0.22‰~0.28‰胆固醇（无水乙醇配）。

32、3.4）接种时罐内压力为0，应趁机接入酸碱泵，连接配制好的1~10m naoh和1~10mhcl。

33、3.5）拧紧接种口旋钮，并利用放空阀恢复罐内压力至0.05~0.1mpa。

34、3.6）控制ph范围为6.5~7.6，溶氧量为30%~70%。

35、3.7）继续利用冷水降温系统，将罐内液体温度降至20~25℃，并开启搅拌系统，将罐内液体混匀。

36、3.8）裂解锥形瓶中养至成虫第1~2他阶段的线虫，获得卵，用无菌的m9 buffer清洗数次。

37、3.9）接种线虫至发酵罐：使用放空阀将罐内压力将至0~0.05mpa，慢慢拧松接种口，在接种口附近塞上沾有酒精的棉花，拧开接种口的瞬间点燃火焰，倒入获得得线虫卵。拧紧接种口旋钮，并利用放空阀恢复罐内压力至0.05~0.1mpa。

38、3.10）次日，线虫已在发酵罐内孵化，加入线虫食物，用无菌的m9 buffer重悬获得的菌体，从接种口接入罐内（接种步骤同上）。

39、3.11）日常检查：线虫生长温度为20~25℃，ph为6.5~7.6，搅拌转速为100~160rpm。

40、3.12）在发酵罐内生长的第8~9天，应取样观察，第二代线虫已长至成虫阶段即可收样。

41、本发明的有益效果：使用发酵罐液体大规模培养线虫，可一次性获得大量线虫个体，大概有1012~1015个个体，此技术可以满足将线虫发展为蛋白表达和纯化的真核体系载体，将过去的低等单细胞工具载体体系上升到活体真核高等多细胞动物体系。这技术最直接的有益效果是：容易生产出具有生物学活性的发酵产物，特别是有功能活性的蛋白质，并且容易维持其活性。