一种基因缺陷导致的小鼠拔毛癖动物模型及其应用

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种基因缺陷导致的小鼠拔毛癖的动物模型及其应用。


背景技术：

2.拔毛症(ttm)(拔毛癖或抠皮症)是一种聚焦于躯体的重复行为(body-focused repetitive behaviour，bfrb)。影响多达0.5％至2％的人口，女性受影响的可能性是男性的四倍。这种紊乱会导致日常功能受损和严重的痛苦。目前现有的动物模型很少能反应人类的这种疾病，也使得该疾病的研究受到一定的阻碍。现有的该疾病的潜在动物模型是近交c57bl/6j小鼠以及偏爱酒精的p大鼠，但这种行为的产生都需要一些外界的诱发因素，如喷洒水雾等。同时建模时间较长，造模成功率低，不适合用于疾病机理研究。
3.本发明在现有的野生型c57bl/6j小鼠基础上，敲除了park9基因，并构建拔毛症动物遗传模型，命名为：b6n.129s-park9
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(以下简称b6n.129s-park9
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敲除模型)。该模型是一种由特定基因功能障碍导致的并可由应激/压力加重的自我重复性频繁的拔毛(或损伤皮肤附属物)或抓挠皮肤致损的异常行为模型。该模型可由外界应激(外界压力、睡眠剥夺、饮食偏好等)进一步诱发并加重其表型。该模型建模时间短，造模成功率高，更适合用于疾病的机理研究，同时可有助于确定针对人类和其他类似的以聚焦于躯体的重复行为疾病的动物的预防和干预措施。该模型小鼠还能进一步用于神经退行性病变、精神类疾病的机理研究，同时可应用于神经类药物筛选等领域。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种基因缺陷导致的小鼠拔毛癖的动物模型，其能够解决目前模型小鼠种类少，建模时间较长、造模成功率低的技术问题。
5.所述基因缺陷导致的小鼠拔毛癖的动物模型为特异性敲除park9基因的c57b6小鼠品系。
6.作为优选，所述拔毛癖为聚焦于躯体的重复行为。
7.作为优选，所述拔毛癖包括拔头部、眉毛、脸颊、胡须、颈项部、背部、胸部、腹部及臀部毛发，采摘皮肤包括抠颈部、背部、脸部皮肤中的一种或多种。并可进一步加重为自我损伤皮肤引起皮肤及至皮下组织的破损及出血。
8.本发明的第二目的在于提供一种基因缺陷导致的小鼠拔毛癖的动物模型的构建方法，该构建方法操作简单，不仅能够降低操作人员的操作难度，还能够节省建模时间，从而提升建模效率。所述方法具体是：将包含同源臂以及park9基因第2至第3外显子的片段进行克隆并扩增，插入loxp位点和neo盒，并顺序组装成靶向载体、重组位点和选择标记，得到条件靶向载体；将所述条件靶向载体转染到小鼠胚胎干细胞内，得到转染细胞；验证所述转染细胞内的目的基因后构建flox小鼠模型，并与cre工具鼠进行繁配，最终得到所述基因缺陷导致的小鼠模型。
9.本发明的第三目的在于提供的这种基因缺陷导致的小鼠拔毛癖的动物模型可以由外界应激(包括但不限于外界压力、睡眠剥夺、饮食偏好等)进一步诱发并加重其表型。同时，基因敲除引起的park9功能障碍，包括但不限于引起行为冲动控制障碍和强迫行为方面的异常。可应用于神经退行性病变、神经精神类病变的基础研究以及用于聚焦于躯体的重复行为疾病的药物筛选。
10.与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：
11.本发明提供了一种基因敲除小鼠模型及其构建方法，以解决目前用于科学研究的拔毛癖动物模型非常有限，且市场没有具有稳定遗传性的基因敲除型小鼠，都需要后天培养改造，建模时间较长，造模成功率低。因此，发明一种有遗传背景的小鼠模型及其构建方法，来实现造模稳定，成功率高，能稳定遗传的拔毛癖模型小鼠来解决上述问题很有必要。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
13.图1为本发明实施例1中park9基因敲除小鼠构建技术示意图；
14.图2为本发明实施例1中park9基因在野生和敲除小鼠中的基因型鉴定结果：其中a为小鼠脚趾dna基因鉴定结果；b为park9在不同脑区海马(hip)，下丘脑(ht)，嗅球(olf)，小脑(cb)，前额皮层(ofc)的蛋白表达结果；
15.图3为本发明实施例2中正常饮食条件下b6n.129s-park9
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小鼠由于拔毛症长期对某个特定部位进行梳理，最终导致其头部、脸部、嘴周、背部、眉部等被毛区脱毛现象的外观图；
16.图4为本发明实施例2中正常饮食条件下b6n.129s-park9
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小鼠由于拔毛症长期对某一特定部位进行梳理，最终导致其背部、颈部皮肤破损的外观图；
17.图5为本发明实施例2中，正常饮食条件下野生型小鼠与b6n.129s-park9
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小鼠在雌性和雄性鼠中拔毛和皮肤抓挠行为的比例图；
18.图6为本发明实施例2中，正常饮食条件下野生型与b6n.129s-park9
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小鼠在一天的上午、下午和晚上时间段中梳理毛发次数的记录(以同一时间段30分钟为统计单位)
19.图7为本发明实施例2中，正常饮食条件下野生型与b6n.129s-park9
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小鼠在一天的上午、下午和晚上时间段中梳理毛发持续时间的记录(以同一时间段30分钟为统计单位)
20.图8为发明实施例2中，正常饮食条件下野生型与b6n.129s-park9
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小鼠在一小时时间段中细分以躯体为中心的重复行为：舔舐、梳理以及抓挠的次数。
21.图9为发明实施例3中，用猫(捕食者)的图像和声音对野生型与b6n.129s-park9
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小鼠进行外界干扰刺激7天，诱发小鼠出现重复拔毛及梳理的行为，并通过视频录像，统计其在30分钟内的梳理行为次数。
22.图10为发明实施例4中，用昼夜颠倒的方式对野生型与b6n.129s-park9
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小鼠进行外界干扰刺激14天，诱发小鼠出现重复拔毛及梳理的行为，并通过视频录像，统计其在
30分钟内的梳理行为次数。
23.图11为发明实施例5中，用生理盐水喂食的方式对野生型与b6n.129s-park9
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小鼠进行外界干扰刺激7天，诱发小鼠出现重复拔毛及梳理的行为，并通过视频录像，统计其在30分钟内的梳理行为次数。
24.图12为发明实施例6中，对3月龄的正常饲养的野生型与b6n.129s-park9
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小鼠给予口服药物f(将药物f溶解于饮用水中，剂量为0.5mg/kg/天)药物处理，7天后分别记录药物处理前后小鼠的梳理、抓挠等行为。
25.图13为发明实施例7中，对3月龄的正常饲养的野生型与b6n.129s-park9
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小鼠给予多种候选药物处理，7天后分别记录药物处理前后小鼠梳理、抓挠行为，筛选有效的缓解小鼠行为药物。
具体实施方式
26.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
27.实施例1：通过park9基因缺陷的方法构建拔毛癖小鼠模型
28.将包含同源臂以及park9基因第2至第3外显子的片段进行克隆并扩增，插入loxp位点和neo盒，并顺序组装成靶向载体、重组位点和选择标记，得到条件靶向载体，将所述条件靶向载体转染到小鼠胚胎干细胞内，得到转染细胞(图1)；验证所述转染细胞内的目的基因后构建flox小鼠模型，并与cre工具鼠进行繁配，最终得到所述基因缺陷导致的小鼠模型，命名为b6n.129s-park9
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。
29.结果显示，通过小鼠脚趾/剪尾基因鉴定，b6n.129s-park9
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小鼠不表达park9基因，所用引物为5
’‑
atgccagtagagagagatagagtg-3’和5
’‑
cagtttatctatgtggctttggtg-2’(图2a)；而取野生型小鼠与b6n.129s-park9
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小鼠脑组织进行蛋白表达实验也同样表明，b6n.129s-park9
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小鼠各脑区均不表达park9蛋白(图2b)。以上结果表明，b6n.129s-park9
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小鼠模型构建成功。
30.实施例2抓挠行为观察
31.正常饲养野生型与b6n.129s-park9
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小鼠3月龄至6月龄，观察小鼠毛发生长情况并拍照记录(图3，图4)。同时，选取10对野生型和b6n.129s-park9
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小鼠，雌雄各半，选择一天中的三个时间段2-6点(上午)，10-14点(中午)，以及18-22点(晚上)各四小时，通过视频拍摄的方式记录小鼠在该时间段的行为。同时，通过双盲的方式选取不同时间段中的30分钟，统计小鼠在半小时内总的梳理次数(图6)和梳理时间(图7)。根据基因型、性别和时间分别统计小鼠的梳理情况(图5)，同时根据视频观察小鼠不同程度的抓挠行为并做统计(图8)。
32.结果显示，缺乏park9的小鼠在3-4个月龄时，头部、眉毛、胡须、脸颊、颈部、背部或胸部出现无毛秃发斑(图3)，雌性b6n.129s-park9
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小鼠比雄性更常见(图5)。此外，大量的毛发拉扯park9敲除小鼠表现出自残的皮肤采摘行为(雌性为8％，雄性为2％)，导致皮肤损伤、表皮撕裂、出血、皮下损伤和肌肉损伤(图4)。对小鼠的视频记录表明，过度梳理和
皮肤抓挠是自我造成的，park9敲除小鼠比野生型小鼠花费大量时间进行重复的自我梳理/毛发抓挠(图5)。park9敲除小鼠表现出整日整夜的梳理行为；它们的梳理次数和总时间显著高于野生型小鼠(图6-7)。在park9敲除小鼠中上述结果，具有高度焦虑的拔毛和拔皮行为障碍类似于女性患者经常出现的拔毛症和抠皮症(ttm)。
33.实施例3视觉和听觉刺激
34.对3月龄的正常饲养的野生型与b6n.129s-park9
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小鼠给予捕食者(猫)的图片和声音刺激5天，再通过视频采集分析小鼠的梳理行为，统计小鼠在半小时内的梳理的次数(图9)。
35.实施例4昼夜节律颠倒刺激
36.对3月龄的正常饲养的野生型与b6n.129s-park9
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小鼠给予昼夜节律颠倒刺激14天，再通过视频采集分析小鼠的梳理行为，统计小鼠在半小时内的梳理的次数(图10)。
37.实施例5生理盐水替饮用水喂食实验
38.对3月龄的正常饲养的野生型与b6n.129s-park9
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小鼠给予生理盐水代替饮用水喂食5天，再通过视频采集分析小鼠的梳理行为，统计小鼠在半小时内的梳理的次数(图11)。
39.实施例3-5中的结果表明，捕食者暴露(图9)，昼夜倒置即昼夜节律变化(图10)或生理盐水作为饮用水(图11)等各种不同刺激形式都能加剧野生型和敲除小鼠的梳理行为。而敲除小鼠的加剧作用远远大于野生型小鼠的影响，加重了park9敲除小鼠的拔毛症状。
40.实施例6药物观察
41.对3月龄的正常饲养的野生型与b6n.129s-park9
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小鼠给予口服药物f(将药物f溶解于饮用水中，剂量为0.5mg/kg/天)，药物处理7天后，分别记录药物处理前后小鼠的梳理、抓挠等行为(图12)。根据结果表明，用现有的临床干预拔毛癖的药物对b6n.129s-park9
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小鼠可有效缓解小鼠的拔毛症状。说明该模型可再现(重复)临床药物的缓解效果，可用于药物的前期筛选。
42.实施例7药物筛选
43.对3月龄的b6n.129s-park9
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小鼠给予多种候选药物处理(剂量均为0.5mg/kg/天)，并将药物f作为对照药物，7天后分别记录药物处理后小鼠梳理、抓挠行为，并与正常饲养的野生型、未给予药物处理的敲除小鼠进行比较(图13)。根据结果表明，药物1有较好的缓解小鼠拔毛症状的效果，而其他药物效果不显著。说应该模型可进一步用于临床候选药物的筛选。
44.尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。