一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法

1.本发明属于胚性愈伤组织培养技术领域，特别是涉及一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法。


背景技术：

2.黑籽南瓜是云南省特有的蔬菜资源，具有优良的抗逆和抗病能力，尤其对瓜类枯萎病具有高抗性，具有十分重要的生产价值及科研价值，为了方便后期的转基因实验，需要快速培养和获取黑籽南瓜的胚性愈伤组织。对此，我们设计一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法来解决上述问题。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
4.本发明为一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：
5.s1、获取外植体，并进行处理后转入s2；
6.s2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养，得到初级愈伤组织后转入s3；
7.s3、初级愈伤组织继代培养基，多次继代培养后转入s4；
8.s4、胚性愈伤组织的和培养。
9.优选地，所述步骤s1中所采取的措施包括以下步骤：
10.s11、选择健康的黑籽南瓜植株，剪取植株嫩叶；
11.s12、将剪取的植株嫩叶在流动的水下冲洗，然后转入超净工作台；
12.s13、对冲洗后的植株嫩叶进行灭菌处理；
13.s14、对灭菌后的植株嫩叶进一步进行处理。
14.优选地，所述步骤s13采取的措施包括以下步骤：
15.s130、采用70％的酒精+0.15％的氯化汞浸泡处理2分钟；
16.s131、采用无菌水冲洗2-3次；
17.s132、采用2％的次氯酸钠消毒20分钟；
18.s134、采用0.1％的升汞溶液消毒2分钟；
19.s135、采用无菌水冲洗5-8次。
20.优选地，所述步骤s14中所采取的措施包括以下步骤：
21.s140、剔除叶片上主脉和边缘部分；
22.s141、将处理后的叶片剪成1cm
×
1cm大小的方块。
23.优选地，所述步骤s2中采取的措施包括以下步骤：
24.s21、采用含有30g/l蔗糖和7g/l琼脂的1/2ms培养基；
25.s22、所述步骤s21中加入10mg/l的维生素b1、1mg/l的维生素b6、1mg/l的甘氨酸、1mg/l的烟酸、100mg/l的肌醇、100mg/l的水解酪蛋白、400mg/l的麦芽提取物、以及4g/l的
植物凝胶；
26.s23、所述步骤s21中还需加入2mg/l的ba、1mg/l的naa以及0-6mg/l的tdz；
27.s24、采用暗培养，并控制培养温度在25
±
1℃，培养4-5周。
28.优选地，所述步骤s3所采取的措施包括以下步骤；
29.s31、将步骤s2中得到的初级愈伤组织转移至继代培养基中，且所述继代培养基与初级愈伤组织培养基相同；
30.s32、全天24h光照，光照强度控制在1500-2000lx，控制温度在23
±
1℃。
31.优选地，所述步骤s4所采取的措施包括以下步骤：
32.s41、将继代培养后的愈伤组织转移至胚性愈伤组织培养基；
33.s42、所述胚性愈伤组织培养基采用含有30g/l蔗糖和7g/l琼脂的1/2ms培养基；
34.s43、所述步骤s42中加入20mg/l的维生素b1、20mg/l的甘氨酸、40mg/l的半胱氨酸、200mg/l的肌醇、200mg/l的水解酪蛋白、800mg/l的麦芽提取物、60mg/l的硫酸腺嘌呤以及4g/l的植物凝胶；
35.s44、所述步骤s43中还需加入1.5mg/l的ba、0.2mg/l的naa以及0.5mg/l的tdz；
36.s45、采用12h光照，光照强度在1000-2000lx之间，温度25℃的环境下进行。
37.优选地，所述步骤s2、s3以及s4中ph均控制在5.6-5.8。
38.本发明具有以下有益效果：
39.1.本发明通过对外植体进行多次灭菌处理，提高了外植体的灭菌效果，有效防止后续愈伤组织的诱导、培养过程，出现组培污染的现象，保证了愈伤组织培养的稳定；
40.2.本发明通过从外植体的培养到初级愈伤组织诱导，初级愈伤组织增殖分化，得到继代培养组织，最后进行胚性愈伤组织的诱导、培养，培养期间通过调整不同激素的浓度，有效提高了愈伤组织的诱导效率，缩短了愈伤组织的诱导、培养时间，达到快速获取愈伤组织的目的，便于黑籽南瓜的快速繁殖以及后期的转基因实验。
41.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
42.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
43.图1为本发明一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法的框图。
具体实施方式
44.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
45.请参阅图1所示，本发明为一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：
46.s1、获取外植体，并进行处理后转入s2；
47.s2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养，得到初级愈伤组织后转入s3；
48.s3、初级愈伤组织继代培养基，多次继代培养后转入s4；
49.s4、胚性愈伤组织的和培养。
50.步骤s1中所采取的措施包括以下步骤：
51.s11、选择健康的黑籽南瓜植株，剪取植株嫩叶；
52.s12、将剪取的植株嫩叶在流动的水下冲洗，然后转入超净工作台，通过采用流动水冲洗2h,对植株嫩叶进行清洁，便于后续的进一步灭菌处理；
53.s13、对冲洗后的植株嫩叶进行灭菌处理；
54.s14、对灭菌后的植株嫩叶进一步进行处理。
55.步骤s13采取的措施包括以下步骤：
56.s130、采用70％的酒精+0.15％的氯化汞浸泡处理2分钟；
57.s131、采用无菌水冲洗2-3次；
58.s132、采用2％的次氯酸钠消毒20分钟；
59.s134、采用0.1％的升汞溶液消毒2分钟；
60.s135、采用无菌水冲洗5-8次。
61.通过对植株嫩叶进行反复浸泡、消毒和冲洗，有效提高了外植体的灭菌效果，保证了后续愈伤组织诱导、培养的顺利开展。
62.步骤s14中所采取的措施包括以下步骤：
63.s140、剔除叶片上主脉和边缘部分；
64.s141、将处理后的叶片剪成1cm
×
1cm大小的方块。
65.步骤s2中采取的措施包括以下步骤：
66.s21、采用含有30g/l蔗糖和7g/l琼脂的1/2ms培养基；
67.s22、步骤s21中加入10mg/l的维生素b1、1mg/l的维生素b6、1mg/l的甘氨酸、1mg/l的烟酸、100mg/l的肌醇、100mg/l的水解酪蛋白、400mg/l的麦芽提取物、以及4g/l的植物凝胶；
68.s23、步骤s21中还需加入2mg/l的ba、1mg/l的naa以及0-6mg/l的tdz；
69.s24、采用暗培养，并控制培养温度在25
±
1℃，培养4-5周。
70.步骤s3所采取的措施包括以下步骤；
71.s31、将步骤s2中得到的初级愈伤组织转移至继代培养基中，且继代培养基与初级愈伤组织培养基相同；
72.s32、全天24h光照，光照强度控制在1500-2000lx，控制温度在23
±
1℃。
73.步骤s4所采取的措施包括以下步骤：
74.s41、将继代培养后的愈伤组织转移至胚性愈伤组织培养基；
75.s42、胚性愈伤组织培养基采用含有30g/l蔗糖和7g/l琼脂的1/2ms培养基；
76.s43、步骤s42中加入20mg/l的维生素b1、20mg/l的甘氨酸、40mg/l的半胱氨酸、200mg/l的肌醇、200mg/l的水解酪蛋白、800mg/l的麦芽提取物、60mg/l的硫酸腺嘌呤以及4g/l的植物凝胶；
77.s44、步骤s43中还需加入1.5mg/l的ba、0.2mg/l的naa以及0.5mg/l的tdz；
78.s45、采用12h光照，光照强度在1000-2000lx之间，温度25℃的环境下进行。
79.步骤s2、s3以及s4中ph均控制在5.6-5.8。
80.实施例一：本发明在获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的过程中，首先选择健康的黑籽南瓜植株，并剪取植株嫩叶，将剪取的植株嫩叶放入烧杯中，在流水下冲洗2h，然后转入超净工作台，用70％的酒精+0.15％的氯化汞浸泡处理2分钟，无菌水冲洗2-3次，2％的次氯酸钠消毒20分钟，0.1％的升汞溶液消毒2分钟，无菌水冲洗5-8次，在无菌条件下，剔除灭菌后叶片上的主脉和边缘部分，最后剪成1cm
×
1cm大小的方块，完成体胚的处理。
81.实施例二：将处理后的体胚接种到初级愈伤组织培养基上，暗培养4-5周得到初级愈伤组织，然后在相同的培养基上继代培养2次，其中8-10天继代一次，最后将继代培养后的愈伤组织转移至胚性愈伤组织培养基上，继续进行继代培养2-3次得到胚性愈伤组织。
82.本发明通过调整初级愈伤组织培养基以及胚性愈伤组织培养基内的激素组合和激素浓度比例，有效提高了愈伤组织的诱导效率，缩短了愈伤组织的诱导和培养时间，达到快速获取胚性愈伤组织的目的，便于黑籽南瓜的快速繁殖以及后期的转基因实验。
83.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。