利用外源多胺提高龙眼胚性愈伤组织生长量和类黄酮含量的方法

d、20 g
∙
l
−1的蔗糖、7 g
∙
l
−1的琼脂、ph为5.8的ms培养基（2,4-d培养基）与添加有1.0 mg
∙
l
−1的2,4-d、0.5 mg
∙
l
−1的激动素（kt）、5 mg
∙
l
−1的agno3、20 g
∙
l
−1的蔗糖、7 g
∙
l
−1的琼脂、ph为5.8的ms培养基（agno3培养基），培养基经高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却凝固后使用。胚性愈伤组织在2,4-d培养基与agno3培养基进行交替培养，培养条件为25℃下暗培养、培养周期为20 d，可以使龙眼胚性愈伤组织连续继代增殖。继代培养20 d的胚性愈伤组织用于后续处理。
8.外源添加剂种类包括腐胺（put），亚精胺（spd），精胺（spm）以及多胺合成抑制剂d-精氨酸（d-arg）。外源添加剂母液的配制方法如下：1）put母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取0.8815 g的put，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；2）spd母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取1.4520 g的spd，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；3）spm母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取2.0330 g的spm，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；4）d-arg母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取1.7420 g 的d-arg，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；龙眼胚性愈伤组织处理培养基由2,4-d培养基与相应外源添加剂母液混合，配置成put处理培养基、spd处理培养基、spm处理培养基和d-arg处理培养基，以添加等体积蒸馏水的2,4-d培养基为对照。各培养基经高压蒸汽灭菌锅灭菌、冷却凝固后使用。
9.用于处理的龙眼胚性愈伤组织为继代培养20 d的龙眼胚性愈伤组织，不同处理培养基所用龙眼胚性愈伤组织接种在直径为9 cm的培养皿中，每个培养皿含20 ml处理培养基。每个培养皿中的龙眼胚性愈伤组织起始接种量均为0.1 g，分布在培养皿中的4个位置。在25℃下进行暗培养，取样时间为继代培养后的20 d、25 d、30 d和35 d。
10.本发明的优点在于：（1）确定了促进龙眼胚性愈伤组织类黄酮积累与生长的最适多胺种类与浓度；（2）确定了龙眼胚性愈伤组织生产类黄酮的最适培养周期。
具体实施方式
11.为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
12.实施例1一种利用外源多胺提高龙眼胚性愈伤组织生长量和类黄酮含量的方法，包括外源多胺种类与浓度的筛选、龙眼胚性愈伤组织的取样时间确定2个方面。
13.龙眼胚性愈伤组织获取方法为：取
‘
红核子’龙眼开花后45 d的幼果，经常规表面消毒后，在无菌条件下取出幼胚，接种到添加有2.0 mg
∙
l
−1的2,4-d、30 g
∙
l
−1的蔗糖、7 g
∙
l
−1的琼脂、ph为5.8的ms培养基中，在25℃下暗培养约40 d，可得到松散、颗粒细小的胚性愈伤组织。所述胚性愈伤组织的继代培养基为添加有1.0 mg
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−1的2,4-d、20 g
∙
l
−1的蔗糖、7 g
∙
l
−1的琼脂、ph为5.8的ms培养基（2,4-d培养基）与添加有1.0 mg
∙
l
−1的2,4-d、0.5 mg
∙
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−1的kt、5 mg
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l
−1的agno3、20 g
∙
l
−1的蔗糖、7 g
∙
l
−1的琼脂、ph为5.8的ms培养基（agno3培养
基），培养基经高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却凝固后使用。胚性愈伤组织在2,4-d培养基与agno3培养基进行交替培养，培养条件为25℃下暗培养、培养周期为20 d，可以使龙眼胚性愈伤组织连续继代增殖。继代培养20 d的胚性愈伤组织用于后续处理。
14.外源添加剂种类包括腐胺（put），亚精胺（spd），精胺（spm）以及多胺合成抑制剂d-精氨酸（d-arg）。外源添加剂母液的配制方法如下：1）put母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取0.8815 g的put，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；2）spd母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取1.4520 g的spd，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；3）spm母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取2.0330 g的spm，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；4）d-arg母液（100 μmol
∙
ml
−1）：使用分析天平称取1.7420 g 的d-arg，用蒸馏水溶解，调ph至5.8，定容到100 ml；龙眼胚性愈伤组织处理培养基由2,4-d培养基与相应外源添加剂母液混合，配置成有效浓度为5 μmol
∙
l
−1、10 μmol
∙
l
−1、50 μmol
∙
l
−1和100 μmol
∙
l
−1的put处理培养基、spd处理培养基、spm处理培养基和d-arg处理培养基（每升处理培养基分别添加50 μl、100 μl、500 μl和1000 μl的外源添加剂母液），以添加等体积蒸馏水的2,4-d培养基为对照。各培养基经高压蒸汽灭菌锅灭菌、冷却凝固后使用。
15.用于处理的龙眼胚性愈伤组织为继代培养20 d的龙眼胚性愈伤组织，不同处理培养基所用龙眼胚性愈伤组织接种在直径为9 cm的培养皿中，每个培养皿含20 ml处理培养基。在超净工作台中进行接种工作，其中每个培养皿的龙眼胚性愈伤组织起始接种量均为0.1 g，分布在培养皿中的4个位置。在25℃的条件下进行暗培养，取样时间为继代培养后的20 d、25 d、30 d和35 d，使用分析天平准确测定各培养皿中的龙眼胚性愈伤组织的生长量。每个处理接种20个培养皿，试验进行3次重复。
16.龙眼胚性愈伤组织类黄酮测定的具体操作如下：1）取样烘干：在继代培养后20 d、25 d、30 d、35 d分别进行取样，使用分析天平测定各处理生长量后用烘箱在50℃下烘干至恒重，烘干后的样品在研钵中磨细，过40目筛子后备用；2）类黄酮提取：用分析天平称取0.0200 g样品粉末，加入2 ml类黄酮提取液（体积百分浓度为60%的乙醇溶液），60℃振荡提取2 h，在离心机中离心（10000 g，10分钟），上清液即为类黄酮提取液；3）类黄酮含量测定：采用苏州科铭生物技术有限公司的“植物类黄酮试剂盒”测定样品类黄酮含量。其原理为：在碱性亚硝酸盐溶液中，类黄酮与铝离子形成在510 nm处有特征吸收峰的红色络合物，测定样品提取液在510 nm处的吸光值，即可计算样品的类黄酮含量。类黄酮含量测定流程见表1。
17.表1样品中类黄酮含量测定流程
%，较培养20 d的ck提高了79.67%。说明本发明中，30 d是对龙眼胚性愈伤组织生长的最适培养时间，10 μmol
∙
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−1的spm培养基提高龙眼胚性愈伤组织生长量的作用最佳，可以达到高产的目的。
21.表2不同处理培养基下龙眼胚性愈伤组织的生长量（g）2）在龙眼胚性愈伤组织继代培养基中分别添加50 μl、100 μl、500 μl和1000 μl的外源添加剂母液，配置成5、10、50和100 μmol
∙
l
−1的d-arg、put、spd和spm处理培养基，以添加等体积蒸馏水为对照，不同培养时间下龙眼胚性愈伤组织的类黄酮积累情况见表3。类黄酮的积累量在不同培养时间的变化趋势整体上呈“倒v”型，在培养30 d时类黄酮含量最
高。外源添加d-arg整体上减少了龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的积累量，且在30 d时抑制作用最明显，5、10、50和100 μmol
∙
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−1的d-arg处理在30 d时的类黄酮含量分别为ck的92.94%、72.86 %、83.01 %和65.75 %。在5、10和50 μmol
∙
l
−1的put处理下龙眼胚性愈伤组织的类黄酮积累量整体上与ck差异不显著，但是高浓度的put处理使龙眼胚性愈伤组织的类黄酮积累量在后期显著低于ck。外源添加spd处理下龙眼胚性愈伤组织的类黄酮积累量与ck的差异较小或显著低于ck。5和10 μmol
∙
l
−1的spm处理整体上促进龙眼胚性愈伤组织的类黄酮积累，且10 μmol
∙
l
−1的spm处理在培养30 d时促进效果最佳，其类黄酮积累量在所有处理中最高，达5.781
ꢀ±ꢀ
0.134 mg
∙g−1，较ck（5.033
ꢀ±ꢀ
0.085 mg
∙g−1）提高了14.86 %；50 μmol
∙
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−1的spm处理整体上也促进龙眼胚性愈伤组织的类黄酮积累；但是100 μmol
∙
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−1的spm处理仅在前期（20-25 d）促进龙眼胚性愈伤组织的类黄酮积累，后期类黄酮积累则低于ck。
22.综上，类黄酮含量的变化趋势呈倒“v”型，在培养后30 d类黄酮含量最高，但是随着培养时间的进一步延长，类黄酮含量开始降低。在不同浓度的d-arg、put、spd和spm处理下培养30 d时，以10 μmol
∙
l
−1的spm处理对龙眼胚性愈伤组织类黄酮积累的促进作用最佳，该处理下龙眼胚性愈伤组织在培养30 d时的类黄酮含量较ck提高了14.86 %，较培养20 d的ck提高了99.97%，说明本发明中10 μmol
∙
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−1的spm培养基可以很好的提高龙眼胚性愈伤组织的类黄酮含量，达到高产的目的。
23.表3不同培养基下龙眼胚性愈伤组织的类黄酮含量（mg
∙g−1）
3）由于龙眼胚性愈伤组织类黄酮相对生产速率与其生长量、类黄酮含量和培养时间密切相关。故设计以下公式对龙眼胚性愈伤组织类黄酮相对生产速率进行计算：类黄酮单日产量 = (生长量
×
类黄酮含量)
ꢀ÷ꢀ
培养天数；类黄酮相对生产速率 = (处理组类黄酮单日产量)
ꢀ÷ꢀ
ck在20 d的类黄酮单日产量。
24.在龙眼胚性愈伤组织继代培养基中分别添加50 μl、100 μl、500 μl和1000 μl的外源添加剂母液，配置成5、10、50和100 μmol
∙
l
−1的d-arg、put、spd和spm处理培养基，以添加等体积蒸馏水为对照，不同培养时间下龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产速率见表4。龙眼胚性愈伤组织类黄酮相对生产速率在不同培养时间的变化趋势整体上呈“倒v”型，在
培养30 d时最高。外源添加的d-arg整体上降低了龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产速率。且在30 d时抑制作用最明显，整体上表现为d-arg浓度越高，抑制效率越显著。外源添加不同浓度的put和spd对龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产速率的影响较小或起抑制作用。外源添加5、10和50 μmol
∙
l
−1的spm能有效提升龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产速率，其中又以10 μmol
∙
l
−1的spm的促进作用最佳，该处理在培养30 d时的类黄酮相对生产速率在所有处理中最高，达2.528
±
0.120，较培养30 d的ck提升了33.62%，较培养20 d的ck提升了152.79 %。100 μmol
∙
l
−1的spm处理在培养20-25 d时类黄酮相对生产速率高于ck，但是在培养后期其类黄酮相对生产速率显著低于ck。
25.综上，不同培养时间下龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产速率的变化趋势整体上呈“倒v”型，在培养30 d时最高。外源添加10 μmol
∙
l
−1的spm培养30 d时龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产速率在所有处理中最高，较培养30 d的ck提升了33.62%，较培养20 d的ck提升了152.79 %。说明本发明中外源添加10 μmol
∙
l
−1的spm可以有效提高龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产速率，且在培养后30 d时类黄酮相对生产效率最高，为最佳培养周期并达到高产的目的。
26.表4不同培养基下龙眼胚性愈伤组织的类黄酮相对生产率
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。