Brevibacillushalotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用

本发明涉及微生物菌种及其应用的，具体的涉及一株耐盐短芽孢杆菌属中新菌brevibacillus halotolerans z-9及其制备的生防菌剂在制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病药物中应用的。

背景技术：

1、棉花黄萎病1914年首次在美国弗吉尼亚州被报道，随后蔓延到包括中国在内的数十个国家和地区，对棉花产量造成巨大损失，成为棉花高产稳产的主要障碍。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(verticillium dahliaekleb)引起的一种棉花土传病害，棉花黄萎病在棉花整个生育期均可发病，一般在3-5片真叶期开始显症，生长中后期棉花现蕾开花后田间大量发病，发病后常导致棉花蕾铃稀少，棉铃提前开裂，造成减产，新疆是我国最主要的棉花生产基地，产量占全国的85％左右。棉花黄萎病的主要防治方法是培育抗病品种、化学防治和生物防治等。其中，培育抗病品种由于缺乏有效的抗病源，目前尚无成功栽培的高抗病品种，化学防治没有有效的杀菌剂，且长期使用容易造成环境污染，化学防治受药效和使用方式的限制，难以发挥作用；生物防治已经有很多微生物被证实具有生防效果，有的已逐步走向应用。许多生防微生物可产生多种抗生素、胞外酶等活性物质，加之孢子抗逆性强，在土传病害防治方面具有较好的应用前景。

2、林忠敏等2001年首次报道了山西省枣果上的一种新病害，命名为枣果黑斑病。枣果黑斑病主要发生在叶子和花器官，并在后期感染果实，枣果上的疾病感染潜伏期长，症状开始出现在8月至9月枣果的白熟期。枣果黑斑病田间典型症状是初期枣果表面腰部或胴部出现深褐色至黑色圆形斑点，随着红枣长大，后病斑不断扩大，成圆形或一些不规则的黑色病斑，病斑一般出现在枣果脐部或顶部，果肉变黑变硬，病变果肉易分离，枣黑斑病的病原物被认为主要由茎点霉属(phomasp)、链孢属(alternariasp)以及毛盘孢属(colletortrichumsp)等真菌引起，一般病果率在30％左右，病重的枣园达80％以上，使枣果产量、品质下降，不能贮存，严重影响了枣果的商品性，给枣农造成重大经济损失，成为生产上亟待解决的难题。枣果黑斑病在早期侵入枣果后在枣果内潜伏侵染，到枣果着色期开始达到发病高峰，因此早期减少病菌对枣花、枣果的侵染对防治该病至关重要。然而新疆红枣花期长达100d左右，在开花期施用化学杀菌剂易导致红枣的落花落果，这给枣果黑斑病的防治造成了一定困难。筛选对枣果黑斑病有良好防效，同时对枣花安全的生物农药对枣果黑斑病的防治具有重要应用价值。

3、生物防治因具有专化性强、防效高、药效持久性好、并且不存在环境污染问题等优点，近年来受到越来越多的重视。随着对耐盐短芽孢杆菌的深入研究，国内外已有文献对耐盐短芽孢杆菌的新物种进行了报道，目前尚无文献和专利报道有关耐盐短芽孢杆菌在枣果黑斑病和棉花黄萎病防治中的应用。

技术实现思路

1、针对现有技术尚未记载有关耐盐短芽孢杆菌在枣果黑斑病和棉花黄萎病防治方面有应用的技术现状，本发明旨在于提供一种短芽孢杆菌属中新菌brevibacillushalotolerans z-9生防菌剂及其应用，通过从新疆图木舒克和阿拉尔棉花和红枣根际土壤分离得到的短芽孢杆菌属中新菌brevibacillus halotolerans z-9，利用brevibacillushalotolerans z-9制备生防菌剂，将其应用于制备防治枣果黑斑病和棉花黄萎病的药物中，brevibacillus halotolerans z-9对棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌抑菌圈直径分别为23.32mm和25.68mm，含有儿茶酚型铁载体，含异羟肟酸型铁载体为阴性，as/ar比值最小值为0.682±0.021，产铁能力最高为“++”。brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂经大田试验，棉花黄萎病病情指数均有所降低，病情指数为7.14，对棉花黄萎病的防治效果最好，达78.07％；brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂50倍稀释配施对枣果黑斑病的防治效果较好，病情指数降低至8.34，发病率抑制至9.58％，第3次施药后，防治效果高达78.07％。表明本发明提供的brevibacillus halotolerans z-9及其制备的生防菌剂对棉花黄萎病和枣果黑斑病均有高效性，且无毒无致病性等副作用，对于制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病的药物具有广泛的应用价值。

2、为了达到以上技术目的，本发明采用如下的技术方案：

3、本发明提供一种brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂，该生防菌剂包括利用耐盐短芽孢杆菌属中新菌种brevibacillus halotolerans z-9发酵获得，其中brevibacillus halotolerans z-9的活菌数不低于108cfu/ml。

4、本发明获得新菌种brevibacillus halotolerans z-9分离筛选自新疆图木舒克和阿拉尔棉花和红枣根际的土壤，并经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的芽孢杆菌(bacillus)范畴内属于耐盐短芽孢杆菌中一株典型的新菌种，该菌种耐盐短芽孢杆菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：cgmcc no.15005，保藏日期：2017年12月04日。

5、上述菌种brevibacillus halotolerans z-9的基因序列如seq id no:1所示。

6、本发明中，brevibacillus halotolerans z-9的液体发酵培养基为：以质量比计，豆饼粉2.0％，酵母粉3.5％，糖蜜1.0％，nacl 0.5％，余量为水，ph值为7.0。

7、同时，本发明提供一种brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

8、(1)将低温保存的菌种编号为z-9的brevibacillus halotolerans在tsa平板培养基上活化，挑取单菌落在tsa斜面培养基上，于30℃培养箱培养48h，即获得活化的菌株brevibacillus halotolerans z-9。

9、(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株brevibacillus halotoleransz-9接种100ml的tsa液体培养基中，在28-32℃、摇床转速为150-180r/min的条件下震荡培养14-16h，获得brevibacillus halotolerans z-9种子液，活菌含量不低于1×108cfu/ml，备用。

10、(3)将步骤(2)所得的brevibacillus halotolerans z-9种子液，按照质量体积比为0.5-1.5％的接种量接入到装有100ml液体发酵培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28-32℃，160-200r/min震荡培养48-72h，获得brevibacillus halotolerans z-9发酵液。

11、(4)检测步骤(3)所得发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时，将发酵液放入储罐中，加入质量比为0.1-0.3％的苯甲酸钠，调节ph值至6.0，其活芽孢数为1×108-1×109cfu/ml，即制备获得brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂。

12、本发明所述一种brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂的制备方法，所述brevibacillus halotolerans z-9种子液的接种量为1％，发酵温度为29℃，发酵时间为56h。

13、本发明所述一种brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂的制备方法，所述防腐剂苯甲酸钠按质量比0.2％的加入量加入。

14、本发明提供一种brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂在制备防治棉花黄萎病药物中的应用。

15、本发明提供一种brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂在制备防治枣果黑斑病药物中的应用。

16、通过实施本发明提供的上述具体技术方案实施本
技术实现要素：
，可以得到以下

17、有益效果：

18、(1)本发明提供一种新菌种brevibacillus halotolerans z-9，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的菌种编号为z-9属于耐盐芽孢杆菌范畴内一种典型的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。

19、(2)提供的brevibacillus halotolerans z-9及其制备的生防菌剂在制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病药物中应用，本发明提供的brevibacillus halotolerans z-9棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌抑菌圈直径分别为23.32mm和25.68mm，含有儿茶酚型铁载体，含异羟肟酸型铁载体为阴性，as/ar比值最小值为0.682±0.021，产铁能力最高为“++”。brevibacillus halotolerans z-9生防菌剂经大田试验，棉花黄萎病病情指数均有所降低，病情指数为7.14，对棉花黄萎病的防治效果最好，达78.07％；brevibacillushalotolerans z-9生防菌剂50倍稀释配施对枣果黑斑病的防治效果较好，病情指数降低至8.34，发病率抑制至9.58％，第3次施药后，防治效果高达78.07％，对于制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病药物中具有广泛的应用价值。