一种高效雌性黄姑鱼成鱼性别逆转的诱导方法与流程

本发明属于雌鱼性别逆转，具体涉及一种高效雌性黄姑鱼成鱼性别逆转的诱导方法。

背景技术：

1、黄姑鱼隶属于鲈形目、鲈亚目、石首鱼科、黄姑鱼属，是我国重要的海水经济鱼类，深受广大消费者的喜爱。实际养殖中黄姑鱼具有生长快，抗逆性强，性成熟周期短（1-2龄），适当人工调控下可实现常年繁殖。同时，黄姑鱼具有典型的性二态性生长特征，雌鱼生长速率显著高于雄鱼。因此，黄姑鱼伪雄鱼的制备，不仅在黄姑鱼的养殖生产中具有潜在的经济效益，而且在石首鱼类的生殖细胞移植、基因编辑育种等研究中也具有重要的应用价值。

2、人工诱导伪雄鱼通常认为只能在幼鱼特定的性别分化时期进行，一旦完成性别分化后，鱼类的性别将不能再改变。因此，目前鱼类的伪雄鱼诱导均开始在幼鱼时期进行。然而，幼鱼时期制备的伪雄鱼需要长时间养殖，直至性成熟时期，存在着病害和养殖条件的影响，容易在养成阶段出现死亡的情况。因此，成鱼进行性别控制，生成伪雄鱼可以节约养殖成本，降低养殖风险。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种雌性黄姑鱼成鱼存活率高、性逆转成功率高的高效雌性黄姑鱼成鱼性别逆转的诱导方法。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、一种高效雌性黄姑鱼成鱼性别逆转的诱导方法，包括：先采用白消安消融雌性黄姑鱼成鱼的卵母细胞，然后采用含有芳香化酶抑制剂的配合饲料对上述处理后的雌性黄姑鱼成鱼进行喂养6-12个月，得到性别逆转成功的黄姑鱼成鱼，芳香化酶抑制剂为来曲唑。白消安是一种双甲基磺酸酯类双功能烷化剂，为细胞周期非特异性药物，进入生物体内后其磺酸酯基团的环状结构打开，通过与细胞dna内的鸟嘌呤起烷化作用而破坏dna的结构与功能。来曲唑是新一代高选择性芳香化酶抑制剂，通过抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，本发明通过将其加入配合饲料中，避免卵母细胞的活力恢复，在白消安和芳香化酶抑制剂在不同阶段的配合作用下，成功使卵母细胞消融，并得到精巢结构，得到雄性黄姑鱼成鱼。

4、优选地，白消安的单次使用量为20-50mg/kg。

5、优选地，白消安的注射次数为2-4次。

6、优选地，芳香化酶抑制剂在配合饲料中的量为80-120mg/kg。

7、本发明采用白消安试剂经生殖孔注射到雌性黄姑鱼成鱼性腺，消融卵母细胞。

8、优选地，卵母细胞的消融中，挑选正常黄姑鱼雌性成鱼，通过鱼用麻醉剂ms-222进行麻醉。以20-50mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性黄姑鱼连续注射2-4次白消安溶液，每次间隔7d，再次培养14-28d后，即完成卵母细胞消融。

9、优选地，卵母细胞的消融中，白消安溶液中加入嘧啶类化合物，嘧啶类化合物为白消安的20-40wt%。

10、优选地，卵母细胞的消融中，白消安溶液中加入l-肉缩氨基酸，l-肉缩氨基酸的使用量为白消安的3-12wt%。在对卵母细胞的消融处理中，发现在白消安和嘧啶基查尔酮存在下，l-肉缩氨基酸的使用，可以提高雌性黄姑鱼性别逆转的成功率。

11、本发明投喂来曲唑诱导卵巢发生性逆转。

12、优选地，性逆转培养中，卵母细胞消融的雌性黄姑鱼诱导性逆转是通过投喂含有芳香化酶抑制剂的配合饲料。完成最后一次白消安注射后第14-28d起开始投喂含有来曲唑的饲料，投喂6-12个月。配合饲料配制中，称取芳香化酶抑制剂溶于少量乙醇，以80-120mg/kg的剂量将芳香化酶抑制剂加入饲料中混匀，随后在室温下晾干。芳香化酶抑制剂为来曲唑。

13、优选地，性逆转培养中，配合饲料中加入嘧啶类化合物，嘧啶类化合物的使用量为芳香化酶抑制剂的20-40wt%。

14、本发明对性逆转黄姑鱼进行检测验证。

15、优选地，黄姑鱼性别检测中，实验期间，每月对实验鱼进行取样，量体长和体重数据，解剖取出性腺，称取重量后，利用波恩氏液固定，通过制作组织切片观察。同时实验期间，检测实验鱼的死亡率并做好记录。

16、优选地，卵母细胞的消融中将嘧啶类化合物或嘧啶基查尔酮与白消安共同使用；嘧啶类化合物由硫脲、乙酰乙酸乙酯和苯甲醛制备得到；嘧啶基查尔酮由嘧啶类化合物与溴烷取代查尔酮反应制成，溴烷取代查尔酮由2'-羟基查尔酮与二溴烷烃反应制成。本发明中通过白消安消融雌性黄姑鱼成鱼的卵母细胞，但白消安使用量的大小对消融卵母细胞的效果有影响，白消安的使用量过低，则收效甚微，白消安的使用量过高，对生物体的影响较大，严重会使受试生物体死亡。本发明在研究中发现，将嘧啶类化合物或嘧啶基查尔酮与白消安共同使用，可以更好提高对卵母细胞的消融效果，能更好的得到性别逆转成功的黄姑鱼成鱼。

17、更优选地，嘧啶类化合物为白消安的20-40wt%。

18、更优选地，嘧啶基查尔酮为白消安的20-40wt%。

19、优选地，嘧啶类化合物的制备中，将硫脲、乙酰乙酸乙酯和苯甲醛加入无水乙醇中，再加入碳酸钾，20-40℃下搅拌混合处理15-60min，然后加热回流反应2-6h，反应完成后，反应体系中加入冰水稀释，然后采用二氯甲烷萃取，分液取有机相，有机相依次采用盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去二氯甲烷，得到嘧啶类化合物。

20、更优选地，嘧啶类化合物的制备中，硫脲的使用量为无水乙醇的1-3wt%。

21、更优选地，嘧啶类化合物的制备中，乙酰乙酸乙酯的使用摩尔量为硫脲使用摩尔量的100%。

22、更优选地，嘧啶类化合物的制备中，苯甲醛的使用摩尔量为硫脲使用摩尔量的100%。

23、更优选地，嘧啶类化合物的制备中，碳酸钾的使用量为硫脲的200-400wt%。

24、更优选地，嘧啶类化合物的制备中，冰水的使用量为反应体系的5倍体积以上，适量即可。洗涤用盐酸溶液的浓度为0.5-2m。萃取剂和其他洗涤液适量使用。

25、优选地，溴烷取代查尔酮的制备中，将2'-羟基查尔酮加入dmf中，然后加入碳酸钾，冰水浴下搅拌1-3h，然后滴加入二溴烷烃反应6-18h，反应完成后，加入冰水，然后加入乙酸乙酯萃取，分液取乙酸乙酯层，然后依次采用盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到溴烷取代查尔酮。

26、更优选地，溴烷取代查尔酮的制备中，2'-羟基查尔酮的使用量为dmf的2-6wt%。

27、更优选地，溴烷取代查尔酮的制备中，碳酸钾的使用量为2'-羟基查尔酮的100-300wt%。

28、更优选地，溴烷取代查尔酮的制备中，二溴烷烃的使用摩尔量为2'-羟基查尔酮使用摩尔量的200-500wt%。

29、更优选地，溴烷取代查尔酮的制备中，冰水的使用量为反应体系的5倍体积以上，适量即可。洗涤用盐酸溶液的浓度为0.5-2m。萃取剂和其他洗涤液适量使用。

30、优选地，嘧啶基查尔酮的制备中，将溴烷取代查尔酮加入dmf中，然后加入碳酸钾，在20-40℃下搅拌混合0.5-2h，然后加入嘧啶类化合物，在90-110℃的温度下反应4-16h，反应完成 后，冷却，反应体系中加入冰水，然后加入二氯甲烷萃取，分液取二氯甲烷层，依次采用盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去二氯甲烷，得到嘧啶基查尔酮。

31、更优选地，嘧啶基查尔酮的制备中，溴烷取代查尔酮的使用量为dmf的1.5-4.5wt%。

32、更优选地，嘧啶基查尔酮的制备中，碳酸钾的使用量为溴烷取代查尔酮的100-300wt%。

33、更优选地，嘧啶基查尔酮的制备中，嘧啶类化合物的使用摩尔量为溴烷取代查尔酮使用摩尔量的100%。

34、更优选地，嘧啶基查尔酮的制备中，冰水的使用量为反应体系的5倍体积以上，适量即可。洗涤用盐酸溶液的浓度为0.5-2m。萃取剂和其他洗涤液适量使用。

35、优选地，配合饲料加入嘧啶类化合物或嘧啶基查尔酮与芳香化酶抑制剂；嘧啶类化合物由硫脲、乙酰乙酸乙酯和苯甲醛制备得到；嘧啶基查尔酮由嘧啶类化合物与溴烷取代查尔酮反应制成，溴烷取代查尔酮由2'-羟基查尔酮与二溴烷烃反应制成。

36、更优选地，嘧啶类化合物的使用量为芳香化酶抑制剂的20-40wt%。

37、更优选地，嘧啶基查尔酮的使用量为芳香化酶抑制剂的20-40wt%。

38、本发明公开了上述方法制备得到的性逆转黄姑鱼成鱼。

39、经本发明方法处理后的雌性黄姑鱼成鱼，通过对其性腺进行组织切片，染色观察分析性腺结构形态，检测发现实验鱼的性腺卵母细胞完全凋亡，并出现类精巢结构，包括生成成熟精子，证实实验鱼性逆转为能够产生精子的雄性黄姑鱼。

40、本发明由于采用白消安消融雌性黄姑鱼成鱼的卵母细胞，然后采用含有芳香化酶抑制剂的配合饲料对上述处理后的雌性黄姑鱼成鱼进行喂养6-12个月，得到性别逆转成功的黄姑鱼成鱼，芳香化酶抑制剂为来曲唑，进一步地可以将白消安与嘧啶类化合物或嘧啶基查尔酮配合使用，因而具有如下有益效果：黄姑鱼成鱼存活率高，存活率为90%以上；性逆转成功率高，成功率为70%以上。因此，本发明是一种雌性黄姑鱼成鱼存活率高、性逆转成功率高的高效雌性黄姑鱼成鱼性别逆转的诱导方法。