一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法与流程

本发明涉及农林科学领域，具体涉及一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法。

背景技术：

1、柑橘是世界第一大水果，面积和产量均居全球第一。我国的柑橘产业宏大，自2008年开始柑橘产业迅速发展，面积达到3046.2万亩，产量达到2331.26万吨，首次名列世界第一。据统计2020年广西柑橘种植面积864.93万亩、产量1382.09万吨、产值346.45亿元，已是全国第一，但目前广西柑橘产业的发展面临严重挑战，造成这个局面主要原因还是与黄龙病有关。

2、柑橘黄龙病菌(candidatusliberibacter，ca.l)属于α–变型菌纲(α-proteobacteria)韧皮部杆菌属(liberibacter)，是一种韧皮部专性寄生的革兰氏阴性细菌，目前无法分离培养的病原菌。其引起的柑橘黄龙病是世界范围内严重危害柑橘生产的重要病害之一。柑橘黄龙病菌可以感染所有柑橘品种和柑橘杂交种等芸香科植物，在柑橘生长周期的各个阶段都能被其感染，并最终导致树木死亡。

3、柑橘黄龙病与柑橘溃疡病一样都属于细菌性病害，目前由于其病原无法像溃疡病在实验室里能够分离出来，造成无法用常规的方法来筛选药剂，当然这也与黄龙病所为害的地方有关。至今为止，由于没有有效的筛选药剂的方法，柑橘黄龙病的防治方法只能停留在“种无病苗、防木虱、砍病树”的初级阶段，造成很多感病的柑橘产区种植面积锐减，种植者的利益受到极大的影响，严重阻碍了柑橘产业的发展。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法。目的是提出用水培法来进行筛选防治柑橘黄龙病病菌药剂，而且该方法简便、快速有效，20到40天内就可以筛选出有效药剂。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其包括如下步骤：利用栽培在含有营养液的水溶液中的感染黄龙病病菌的柑橘苗，向所述的含有营养液的水溶液里面根施筛选的药剂，培养至少20天，后通过检测柑橘苗残留的药剂浓度，及通过pcr检测柑橘苗黄龙病病菌的数量，以此来评价药效。

3、本发明的有益效果是：本发明采用栽培在含有营养液的水溶液中的感染黄龙病病菌的柑橘苗的作为评价材料，通过在所述的含有营养液的水溶液里面根施筛选的药剂，只需通过检测柑橘苗残留的药剂浓度，及通过pcr检测柑橘苗黄龙病病菌的数量来评价药效，在20-40天即可筛选出有效抗柑桔黄龙病病菌的化学药剂。且提供的快速、有效的抗黄龙病病菌化学药剂筛选方法，筛选得到的高效柑桔黄龙病病菌防控药剂，可在生产上直接用于柑桔黄龙病病菌的化学防治药剂，还可为防治柑桔黄龙病病菌的新型药剂的研究与开发提供理论参考。

4、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

5、进一步，其包括如下具体的步骤：

6、步骤1，苗木接毒：把栽培在含有营养液的水溶液中的没有感染黄龙病病菌的柑橘苗接种黄龙病病菌，得到感染黄龙病病菌的柑橘苗；

7、步骤2，根施药剂：将步骤2得到的感染黄龙病病菌的柑橘苗的含有营养液的水溶液里面根施筛选的药剂，在光照强度3000-4000lux，环境温度25±2℃条件下，培养至少20天，得到待检测的柑橘苗；

8、步骤3，药效评价：检测步骤2得到的待检测的柑橘苗的根部及顶叶的残留的药剂浓度，及通过pcr检测柑橘苗的根部及顶叶的黄龙病病菌的数量，以此来评价药效。

9、采用上述进一步方案的有益效果是：通过该方法可以在短时间内采用栽培在含有营养液的水溶液中的感染黄龙病病菌的柑橘苗，对柑桔黄龙病防控药剂进行快速筛选与评价，解决了目前抗黄龙病病菌化学药剂筛选周期过长，缺乏一套准确、有效的评价体系等不足的问题。

10、进一步，所述步骤1中，所述接种黄龙病病菌具体为：通过将感染黄龙病病菌的柑橘接穗芽嫁接到没有感染黄龙病病菌柑橘苗上。

11、进一步，所述步骤2中，在光照强度3000-4000lux，环境温度25±2℃条件下，培养20-40天，得到待检测的柑橘苗。

12、进一步，所述药剂为内吸性杀菌剂。其中内吸性杀菌剂为能通过植物叶、茎、根部吸收进入植物体，在植物体内输导至作用部位的杀菌剂。

13、进一步，所述内吸性杀菌剂包括噻唑类杀菌剂，每1kg所述含有营养液的水溶液中所述噻唑类杀菌剂的用量为200-800mg。

14、目前杀菌剂的种类很多，分为杀真菌剂、杀细菌剂和杀病毒剂等，它们之间是不能通用互换的，也就是说杀真菌剂不能杀细菌和病毒，杀细菌剂也不能杀真菌和病毒。但是噻唑类杀菌剂比较特殊，既可以杀细菌也可以杀真菌，同时又具有很好的内吸作用，能通过植物叶、茎、根部吸收进入植物体，在植物体内输导至作用部位的杀菌剂，因此作为细菌性病害的治疗剂是比较理想的。

15、进一步，所述噻唑类杀菌剂为噻森铜(购买于浙江东风化工有限公司)、异噻唑啉酮(购买于山东优索化工科技有限公司)，噻唑锌(购买于浙江新农化工股份有限公司)或噻霉酮(购买于陕西西大华特科技实业有限公司)。

16、进一步，所述pcr检测采用的引物对为hlbas和hlbp，hlbas核苷酸序列为seq idno：1，hlbp核苷酸序列为seq id no：2：所述pcr检测用到的探针为hlbp，hlbp核苷酸序列为seq id no：3。

17、进一步，所述营养液为通过水溶性肥料和有机液肥配制而成，且所述营养液的ph值为5.5-6.5，有机质的质量含量为15-30g/kg，总氮的质量含量为1.0-1.5g/kg，速效磷的质量含量为20-80mg/kg，速效钾的质量含量为100-200mg/kg，交换性钙的质量含量为1000-2000mg/kg，交换性镁的质量含量为150-300mg/kg，有效铜的质量含量为0.5-1.0mg/kg，有效铁的质量含量为10-20mg/kg，有效锰的质量含量为50-200mg/kg，和有效锌的质量含量为1-5mg/kg。

18、其中，水溶性肥料(water soluble fertilizer，简称wsf)，是一种可以完全溶于水的多元复合肥料，它能迅速地溶解于水中，更容易被作物吸收，而且其吸收利用率相对较高。有机液肥是一种高浓缩、高肥效、多功能、全营养增效型的新型肥料。相对对传统的化肥它能够在极短时间里被植物吸收，避免流失，且施用简单方便，容易运输储存。

19、进一步，所述营养液的ph值为5.5-6.5，有机质的质量含量为20-25g/kg，总氮的质量含量为1.1-1.4g/kg，速效磷的质量含量为40-60mg/kg，速效钾的质量含量为120-180mg/kg，交换性钙的质量含量为1200-1800mg/kg，交换性镁的质量含量为200-350mg/kg，有效铜的质量含量为0.6-0.9mg/kg，有效铁的质量含量为12-18mg/kg，有效锰的质量含量为100-150mg/kg，和有效锌的质量含量为2-4mg/kg。

技术特征：

1.一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，其包括如下步骤：利用栽培在含有营养液的水溶液中的感染黄龙病病菌的柑橘苗，向所述的含有营养液的水溶液里面根施筛选的药剂，培养至少20天，后通过检测柑橘苗残留的药剂浓度，及通过pcr检测柑橘苗黄龙病病菌的数量，以此来评价药效。

2.根据权利要求1所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，其包括如下具体的步骤：

3.根据权利要求2所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述步骤1中，所述接种黄龙病病菌具体为：通过将感染黄龙病病菌的柑橘接穗芽嫁接到没有感染黄龙病病菌柑橘苗上。

4.根据权利要求2所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述步骤2中，在光照强度3000-4000lux，环境温度25±2℃条件下，培养20-40天，得到待检测的柑橘苗。

5.根据权利要求1或2所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述药剂为内吸性杀菌剂。

6.根据权利要求5所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述内吸性杀菌剂为噻唑类杀菌剂，每1kg所述含有营养液的水溶液中所述噻唑类杀菌剂的用量为200-800mg。

7.根据权利要求6所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述噻唑类杀菌剂为噻森铜、异噻唑啉酮，噻唑锌或噻霉酮。

8.根据权利要求1或2所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述pcr检测采用的引物对为hlbas和hlbp，hlbas核苷酸序列为seq id no：1，hlbp核苷酸序列为seq id no：2：所述pcr检测用到的探针为hlbp，hlbp核苷酸序列为seq id no：3。

9.根据权利要求1或2所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述营养液为通过水溶性肥料和有机液肥配制而成，且所述营养液的ph值为5.5-6.5，有机质的质量含量为15-30g/kg，总氮的质量含量为1.0-1.5g/kg，速效磷的质量含量为20-80mg/kg，速效钾的质量含量为100-200mg/kg，交换性钙的质量含量为1000-2000mg/kg，交换性镁的质量含量为150-300mg/kg，有效铜的质量含量为0.5-1.0mg/kg，有效铁的质量含量为10-20mg/kg，有效锰的质量含量为50-200mg/kg，和有效锌的质量含量为1-5mg/kg。

10.根据权利要求9所述一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，其特征在于，所述营养液的ph值为5.5-6.5，有机质的质量含量为20-25g/kg，总氮的质量含量为1.1-1.4g/kg，速效磷的质量含量为40-60mg/kg，速效钾的质量含量为120-180mg/kg，交换性钙的质量含量为1200-1800mg/kg，交换性镁的质量含量为200-350mg/kg，有效铜的质量含量为0.6-0.9mg/kg，有效铁的质量含量为12-18mg/kg，有效锰的质量含量为100-150mg/kg，和有效锌的质量含量为2-4mg/kg。

技术总结
本发明涉及一种防治柑橘黄龙病病菌药剂筛选方法，涉及农林科学领域，利用栽培在含有营养液的水溶液中的感染黄龙病病菌的柑橘苗，向所述的含有营养液的水溶液里面根施筛选的药剂，培养至少20天，后通过检测柑橘苗残留的药剂浓度，及通过PCR检测柑橘苗黄龙病病菌的数量，以此来评价药效。本发明提出用水培法来进行筛选防治柑橘黄龙病病菌药剂，而且该方法简便、快速有效，20到40天内就可以筛选出有效药剂。

技术研发人员：张戈壁,雷翠云,傅翠娜,娄兵海,张松,张素英
受保护的技术使用者：广西特色作物研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12