一种紫菀的组织培养方法与流程

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种紫菀的组织培养方法。


背景技术：

2.紫菀（aster tataricus l. f.），属于菊科紫菀属植物，为多年生草本，常用作药用植物。因紫菀植株具有较高的观赏价值，又可做观赏植物，适用于花境布置、私家花园庭院栽植以及盆栽观赏，具有良好的市场前景。
3.紫菀的传统繁殖方式主要可以分为播种繁殖、扦插繁殖以及分株繁殖，上述繁殖方式的繁殖效率较低，种苗整齐度差，不利于产业化推广。因此，传统的紫菀繁殖方式明显限制了紫菀的应用。
4.目前针对紫菀的组织培养技术的研究尚较少，而且，现有的紫菀的组织培养方法的污染率和死亡率较高，繁殖效率也有待提高。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种紫菀的组织培养方法以及用于紫菀组织培养的培养基。
6.具体地，本发明提供以下技术方案：本发明提供一种紫菀的组织培养方法，所述方法包括：以紫菀茎段顶部的幼嫩部分作为外植体，依次进行诱导外植体腋芽萌发培养、腋芽增殖培养和诱导不定芽生根培养。
7.现有的紫菀组织培养方法多采用块茎牙眼、根状茎等作为外植体诱导愈伤组织，存在污染率高、死亡率高、繁殖效率低等问题。本发明发现，选择不同的母株部位作为外植体进行紫菀组织培养，直接影响紫菀组织培养的污染率、死亡率、繁殖效率和组培的最终结果。本发明选择紫菀的茎段顶部的幼嫩部分作为外植体进行组织培养，并发现茎段顶部的幼嫩部分细胞能够在离体培养条件下具有更高的分裂活性，配合适宜的离体培养基能够在离体培养条件下旺盛分裂，在一定程度上可提高组织培养的诱导率和成功率，同时能够有效缩短组织培养过程中的诱导周期，并提高增殖系数和生根率。而且，本发明还发现，选择生长期较短的茎段顶部的幼嫩部分作为外植体，茎段顶部的幼嫩部分受到外界的干扰较小，可有效降低紫菀组织培养的污染率。此外，与选择紫菀的其他部位作为外植体进行组织培养相比（例如：以块茎芽眼为外植体，消毒成功率较低（35%），且需要取植株的地下块茎部分，取材不便，对植株损伤较大，不利于生产实施），茎段顶部的幼嫩部分取材更加容易，且茎段顶部的幼嫩部分的取材对于母株的伤害较小，更加有利于对母株的保护以及在组织培养中对母株的重复利用，从而提高组织培养的繁殖效率，降低组织培养的成本。
8.本发明的紫菀组织培养方法中，以生长健壮且无病虫害的紫菀母株的茎段顶部的幼嫩部分作为外植体进行组织培养。
9.优选地，上述方法以母株上生长期为20-50天且处于开花期前的茎段顶部的幼嫩部分作为外植体。
10.进一步优选地，茎段顶部的幼嫩部分已完全展开。
25-30g/l，琼脂4-4.5g/l；腋芽增殖培养使用的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 0.1-0.2mg/l，iba（吲哚丁酸） 0.1-0.2mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-4.5g/l。
21.在本发明的一些实施方式中，诱导外植体腋芽萌发培养使用的培养基为在ms培养基中添加6-ba 0.1-0.5mg/l，naa 0.1-0.5mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4.5-5g/l得到；腋芽增殖培养使用的培养基为在ms培养基中添加6-ba 0.1-0.5mg/l，iba 0.1-0.2mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-4.5g/l得到。
22.上述组织培养方法中，诱导不定芽生根培养使用的培养基以1/2 ms培养基为基本培养基并包含如下组分：活性炭 0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-5g/l。
23.优选地，上述诱导不定芽生根的培养基中，不添加植物激素。
24.已有的紫菀组培方法中，生根培养步骤通常会加入一种或多种植物激素。本发明发现，配合上述诱导外植体腋芽萌发培养和腋芽增殖培养，在诱导不定芽生根阶段，不添加植物激素即能够获得较高的生根率（可达100%的生根率）。腋芽能够在生根培养基及自身合成的各类激素的共同作用下，促进增殖后的不定芽生根形成小苗。在诱导不定芽生根的培养基中，还加入了活性炭。活性炭能够吸附不定芽的代谢产物，增强培养基的通透性。
25.进一步优选地，诱导不定芽生根培养使用的培养基以1/2 ms培养基为基本培养基并包含如下组分：活性炭 0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l。
26.在本发明的一些实施方式中，诱导不定芽生根培养使用的培养基为在1/2 ms培养基中添加活性炭 0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l得到。
27.上述诱导外植体腋芽萌发培养、腋芽增殖培养和诱导不定芽生根培养使用的培养基的ph优选为5.8-6.0。
28.以上所述的组织培养方法中，诱导外植体腋芽萌发培养、腋芽增殖培养和诱导不定芽生根培养优选采用以下条件：培养温度为23-27℃，光照强度为1500-2300 lux，光照时长为8-10h/d。
29.以上所述的组织培养方法中，在诱导外植体腋芽萌发培养前，对外植体进行消毒处理；所述消毒处理包括：先以水冲洗后，再依次进行0.05-0.15%新洁尔灭溶液处理、70-80%酒精消毒和0.05-0.15%氯化汞溶液处理。
30.上述处理优选为浸泡震荡处理。
31.采用新洁尔灭溶液和酒精浸泡震荡消毒后，可杀灭附着在材料表面的部分病原体，有效排除外植体表面可能附带的污染源的干扰，并可有效增加消毒剂对外植体材料表面的浸透性，提高外植体消毒的成功率。氯化汞能够杀死繁殖体、亲脂性病毒等，对外植体携带的病原体等具有很强的杀灭作用，进一步提高外植体消毒的成功率。本发明中，先用新洁尔灭溶液作为阳离子表面活性剂的杀菌作用，对分枝点较多的茎段进行初步处理，再利用酒精较强的浸润作用，排除外植体表面的空气，利于氯化汞的渗入，从而提高氯化汞对外植体材料表面的浸透性，提高消毒剂的消毒效果。
32.优选地，所述新洁尔灭溶液处理的时间为10-15min；所述酒精消毒的时间为30-60s；所述氯化汞溶液处理的时间为5-9min。
33.氯化汞对植物杀伤作用较大，若浸泡时间过长，植物器官的生长会受到影响，甚至
会被杀死，因此，利用氯化汞对外植体消毒时要严格控制浸泡时间，经过试验，本发明将外植体浸泡在氯化汞溶液中的浸泡时间控制在5-9min。
34.优选地，新洁尔灭溶液处理使用0.1%新洁尔灭溶液，酒精消毒使用75%酒精。氯化汞溶液处理使用0.1%氯化汞溶液。
35.优选地，在新洁尔灭溶液处理后、酒精消毒后和氯化汞溶液处理后均以无菌水进行清洗外植体。
36.在本发明的一些实施方式中提供一种紫菀的组织培养方法，所述方法包括：外植体的获取和消毒、诱导外植体腋芽萌发、腋芽增殖以及诱导不定芽生根。
37.另一方面，本发明还提供用于紫菀组织培养的培养基，所述培养基包括诱导外植体腋芽萌发培养基、腋芽增殖培养基和诱导不定芽生根培养基；其中，所述诱导外植体腋芽萌发培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 0.1-0.5mg/l，naa 0.1-0.5mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-5g/l；所述腋芽增殖培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 0.1-0.5mg/l，iba 0.1-0.2mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-5g/l；所述诱导不定芽生根培养基以1/2 ms培养基为基本培养基并包含如下组分：活性炭 0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-5g/l。
38.本发明还提供以上所述的用于紫菀组织培养的培养基在紫菀组织培养中的应用。
39.优选地，所述应用为以紫菀的茎段顶部的幼嫩部分作为外植体进行组织培养。
40.本发明的有益效果在于：本发明选择紫菀母株的茎段顶部的幼嫩部分作为外植体进行紫菀的组织培养，并针对该外植体开发了适宜的诱导外植体腋芽萌发、腋芽增殖以及诱导不定芽生根的培养培养基和培养方法。利用本发明的紫菀组织培养方法，能够有效提高紫菀腋芽的诱导成功率，降低紫菀组织培养的污染率和死亡率，缩短组织培养过程中的诱导周期，提高紫菀的增殖系数和生根率，从而提高紫菀的繁殖效率，降低季节对该紫菀生产的限制，促进紫菀的应用。
附图说明
41.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
42.图1是利用实施例1的组织培养方法进行紫菀组织培养过程中，诱导外植体腋芽萌发的示意图。
43.图2是利用实施例2的组织培养方法进行紫菀组织培养过程中，腋芽增殖分化形成丛生腋芽的示意图。
44.图3是利用实施例2的组织培养方法进行紫菀组织培养过程中，不定芽生根的示意图。
具体实施方式
45.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本
发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.以下实施例中使用的酒精为欧洁75%消毒酒精（500ml规格），购自杭州欧拓普生物技术有限公司；氯化汞为购自天津市光复精细化工研究所的氯化汞标准溶液。
47.以下实施例中使用的紫菀母株来源于北京花乡花卉科技研究所有限公司。
48.本发明提供一种紫菀的组织培养方法，具体包括以下步骤：1. 外植体的获取和消毒（1）外植体的获取：选择生长健壮、无病虫害的母株，选取生长期为20-50d、花期前的母株上的茎段顶部的幼嫩部分；（2）外植体的消毒：冲洗：将步骤（1）获取的茎段顶部的幼嫩部分去除下部多余叶片，于流动的自来水下冲洗10min，晾干；新洁尔灭溶液震荡处理：置于0.1%新洁尔灭溶液中浸泡震荡消毒10-15min，后用无菌水震荡清洗3-5遍，每次1-2min；酒精消毒：晾干后，置于75%的酒精中浸泡震荡消毒30-60s，后用无菌水震荡清洗1-2遍，每次1-2min；0.1%的氯化汞溶液处理：再将茎段顶部的幼嫩部分置于0.1%的氯化汞溶液中浸泡震荡5-9min，后用无菌水震荡清洗3-5遍，每次1-2min；裁剪：将消毒后的茎段基部损伤部位切除，然后分割成长为1-2cm的带芽点小段，获得待诱导的外植体。
49.2. 诱导外植体腋芽萌发将步骤1获得的待诱导的外植体竖直插入诱导外植体腋芽萌发的培养基中，诱导外植体腋芽萌发，获得与茎段一体的腋芽。
50.其中，该步骤中用到的培养基配方为：ms培养基，6-ba（6-苄氨基腺嘌呤）0.1-0.5mg/l，naa（萘乙酸）0.1-0.5mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-5g/l，ph5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800lux，光照时长为8-10h/d。
51.3. 腋芽增殖将步骤2获得的与茎段一体的腋芽从茎段上分离出来，并将分离出来的腋芽接种到诱导腋芽增殖的培养基中，获得增殖后的丛生芽。
52.其中，该步骤中用到的培养基配方为：ms培养基，6-ba 0.1-0.5mg/l，iba 0.1-0.2mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-5g/l，ph5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800 lux，光照时长为8-10h/d。
53.4. 诱导不定芽生根将步骤3获得的增殖后的丛生芽相互分离成单个的芽，接种到诱导不定芽生根的培养中。
54.其中，该步骤中用到的培养基配方为：1/2 ms培养基，ac（活性炭）0.3-0.5g/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-5g/l，ph5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1800-2500lux，光照时长为8-10h/d。
55.以下结合实施例1-5、对比例1-7、图1-3以及检测试验对本发明的技术方案进行进一步详细说明。
56.实施例1本实施例提供一种紫菀的组织培养方法，具体包括以下步骤：1. 外植体的获取和消毒（1）外植体的获取：选择生长健壮、无病虫害的母株，选取母株上开花期前、生长期为35d的茎段顶部的幼嫩部分；（2）外植体的消毒：冲洗：将步骤（1）获取的茎段顶部的幼嫩部分于流动的自来水下冲洗10min，晾干；新洁尔灭溶液震荡处理：置于0.1%新洁尔灭溶液中浸泡震荡消毒10min，后用无菌水震荡清洗3遍，每次1min；酒精消毒：晾干后，将茎段顶部的幼嫩部分置于75%的酒精中浸泡震荡消毒45s，后用无菌水震荡清洗1遍，每次1min；0.1%的氯化汞处理：再将茎段顶部的幼嫩部分置于0.1%的氯化汞溶液中浸泡震荡5min，后用无菌水震荡清洗3遍，每次1min；裁剪：将消毒后的茎段基部损伤部位切除，然后分割成长为1cm的带芽点小段，获得待诱导的外植体。
57.2. 诱导外植体腋芽萌发将步骤1获得的待诱导的外植体接种至诱导外植体腋芽萌发的培养基中，诱导外植体腋芽萌发，2周后获得与茎段一体的腋芽。
58.3. 腋芽增殖将步骤2获得的与茎段一体的腋芽从茎段上分离出来，并将分离出来的腋芽接种到诱导腋芽增殖的培养基中，3周后获得增殖的丛生芽。
59.4. 诱导不定芽生根将步骤3获得的丛生芽相互分离，获得单独的不定芽，并将不定芽接种到诱导不定芽生根的培养中。
60.上述各步骤涉及的条件参数以及用到的培养基配方如表1所示。
61.表1 实施例1-3和对比例1-4的各步骤涉及的参数和用到的培养基配方
实施例2本实施例提供一种紫菀的组织培养方法，其与实施例1的步骤流程相同，区别之处在于部分步骤的条件参数和用到的培养基配方，具体如表1所示。除表1中列出的条件参数和培养基外，实施例2的方法步骤与实施例1均相同。
62.实施例3本实施例提供一种紫菀的组织培养方法，其与实施例1的步骤流程相同，区别之处在于部分步骤的条件参数和用到的培养基配方，具体如表1所示。除表1中列出的条件参数和培养基外，实施例3的方法步骤与实施例1均相同。
63.对比例1-4
对比例1-4分别提供一种紫菀的组织培养方法，其与实施例1的区别之处在于部分步骤的条件参数和用到的培养基配方，具体如表1所示。除表1中列出的条件参数和培养基外，对比例1-4的方法步骤与实施例1均相同。
64.实施例4-5实施例4-5分别提供一种紫菀的组织培养方法，其与实施例1的区别之处在于作为外植体的茎段顶部的幼嫩部分在母株上的生长期，具体如表2所示。除表2中列出的条件参数外，实施例4-5的方法步骤与实施例1均相同。
65.对比例5-7对比例5-7分别提供一种紫菀的组织培养方法，其与实施例1的区别之处在于外植体的选材以及消毒裁剪步骤，具体如表2所示。除表2中列出的条件参数外，对比例5-7的方法步骤与实施例1均相同。
66.表2 实施例1、实施例4-5、对比例5-7的外植体的选材及获取和消毒裁剪实验例利用实施例1-5以及对比例1-7提供的组织培养方法对紫菀进行培养，期间记录外植体消毒阶段的污染率、褐化死亡率和各培养阶段的考察参数，并计算腋芽诱导率，腋芽增殖系数以及不定芽生根率，具体的检测项目结果如表3所示。同时，记录紫菀培养过程中腋芽诱导情况和分化苗长势的情况，具体记录结果如表4所示。其中，利用实施例1的组织培养方法进行紫菀组织培养过程中，诱导外植体腋芽萌发的示意图如图1所示，利用实施例2的组织培养方法进行紫菀组织培养过程中，腋芽增殖分化形成丛生腋芽的示意图如图2所示，利用实施例2的组织培养方法进行紫菀组织培养过程中，不定芽生根的示意图如图3所示。
67.表3紫菀的组织培养的结果（1）
表4 紫菀的组织培养的结果（2）
结合实施例1-5以及对比例1-7的组织培养方法以及表3和表4的结果，本发明选择母株上生长期为20-50d茎段顶部的幼嫩部分作为外植体，同时在各组织培养阶段选择合适的培养基配方和培养条件，进行紫菀的组织培养，不仅提高了紫菀外植体的消毒成功率，而且缩短了诱导周期，提高了腋芽增殖倍率，同时，紫菀的生根效果较好，进而提高了紫菀的移栽成活率，降低季节对该品种生产的限制，从而促进紫菀的应用。
68.首先，选择合适的消毒剂配合使用，能较大提高消毒的成功率。通过表3中对比例3的消毒结果可知，在消毒阶段去掉新洁尔灭的使用后，污染率增加至40%。本发明中，先用新洁尔灭溶液作为阳离子表面活性剂的杀菌作用，对分枝点比较多的茎段进行初步处理，再配合酒精和氯化汞的使用，能显著提高消毒成功率。
69.再者，选择合适的母株部位作为外植体进行紫菀的组织培养，直接影响紫菀组织培养的最终结果。对比实施例1和对比例5-7的培养结果，在相同组织培养条件和无病虫害的要求下，实施例1选择的外植体为母株上生长期为35d的茎段顶部的幼嫩部分，而对比例5-7选择的外植体分别为母株上顶稍叶片的叶柄、母株上新生长未完全展叶的嫩叶片、母株
上的老叶片。通过表3和表4可知，利用实施例1的组织培养方法诱导，腋芽正常萌出，且腋芽生长迅速，无玻璃化现象，且分化苗长势较好，植株茁壮，增殖率高；而利用对比例5-7的组织培养方法结果为：对比例5以叶柄为外植体，有蓬松愈伤组织形成，愈伤组织未分化成不定芽，对比例6在消毒后叶片一半褐化死亡，无愈伤组织和不定芽形成，对比例7选择叶片外植体，有少量愈伤组织形成，愈伤组织未分化成不定芽。综上所述，外植体的选择对紫菀组织培养的效果影响较大，选择合适的母株部位作为外植体进行紫菀组织培养，能够提高紫菀组织培养的效果。本发明选择茎段顶部的幼嫩部分作为紫菀的组织培养的外植体，能够有效提高紫菀的诱导率、增殖系数，缩短紫菀生产周期。
70.进一步地，在诱导外植体腋芽萌发步骤中，6-ba的添加量也对组织培养的效果也有较大影响。对比例2的中6-ba的添加量为2.0mg/l，通过表4可知，对比例2的培养结果有腋芽簇生，易形成节间极短的畸形芽，生长迟缓等问题出现。由此可见，在诱导外植体腋芽萌发步骤中，6-ba的添加量应该控制在合理范围内。本发明选择6-ba的添加量为0.1-0.5mg/l，能够在较高的诱导率和增殖率基础上，培养出茁壮的分化苗。
71.另外，诱导外植体腋芽萌发和腋芽增殖这两个步骤中植物激素的配合选择也会影响紫菀组织培养的结果。通过表3和表4可知，对比例1选择6-ba和naa的组合作为诱导外植体腋芽增殖的培养基配方，增殖系数低（2.2倍），且叶片深绿，植株长势缓慢，似植株老化现象；而实施例1-5选择6-ba和iba的组合作为腋芽增殖的培养基配方，植株健壮，且增殖系数高（4.1-4.5倍）。由此可见，在诱导腋芽增殖步骤中，iba起到了naa无法替代的作用，可明显提高紫菀的增殖率。
72.再者，在诱导不定芽生根阶段，由表3可知，对比例4在生根培养基中加入了生长素，与其他对比例不加激素对比，无明显差异性，生根率都能达到100%。组培苗生根阶段减少激素的使用，不仅节约生产成本，还能提高组培苗移栽后对无激素外界环境的适应性。故在本发明的外植体选择、腋芽诱导和增殖的合适培养基配方下，生根培养基中不添加植物激素即能够获得100%生根率，能够减少激素对组培苗移栽成活率的影响。
73.综上所述，本发明提供的紫菀组织培养方法中，外植体选择母株上生长期为20-50d的茎段顶部的幼嫩部分，茎段顶部的幼嫩部分取材容易，不受季节限制，且对母株伤害较小。配合适宜的各阶段培养的培养基，外植体能够直接诱导出腋芽，诱导成功率高，缩短了诱导周期，提高了腋芽增殖系数，同时，紫菀的生根效果较好，生根率达到100%，提高了紫菀的移栽率，从而促进了紫菀的应用。
74.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。