一种短萼仪花的组培快繁方法

1.本发明属于植物的组织培养技术领域，具体涉及一种短萼仪花的组培快繁方法。


背景技术：

2.短萼仪花(lysidice brevicalyx wei)为苏木科(caesalpiniaceae)仪花属(lysidice)常绿乔木，又名马忆木，株型挺拔、树冠圆散，花多色艳，花期长且开放整齐，是观赏价值较高的优良乡土树种。短萼仪花产于我国南部和西南部，分布在广东、广西、贵州以及云南等地，生于海拔500～1000m的疏林或密林中，常见于山谷溪边，其具有很高的观赏价值，是华南地区极具开发潜力的乡土园林树种。短萼仪花的用途也非常广泛，其木材黄白色，坚硬，是优良建筑用材。根、茎、叶可以作为中药使用，能够起到消炎止痛，祛热散瘀等功效。
3.近年来，短萼仪花野生资源及其原生境遭到破坏，资源量和分布呈缩小的趋势，该种已被列入广东省省级保护珍稀树种。目前，有关短萼仪花的研究目前主要集中在形态学研究、药用研究和生物群落多样性研究等内容上，而在繁殖育苗技术方面研究较少，仅见梁国凌等(2000年，仪花繁育栽培试验初报)、苏纯兰等(2015年，短萼仪花种子育苗技术)、熊基粦等(2018年，短萼仪花育苗技术探讨)对其种子育苗技术进行报道，尚未见其组培快繁技术研究报道。
4.短萼仪花是我国特有的稀有植物，由于人为干扰及外来树种的排挤导致原生境恶化，缩小了其种群，加之荚果受虫害严重，且其种粒较大、种皮革质、外层被腊不易透水，存在种子吸水困难、发芽率极低等问题，进一步加剧了该种的濒危程度。综上所述，本发明首次以短萼仪花优良单株的种子为外植体，通过种子处理、无菌系建立、基本培养基筛选、激素种类与配比、培养环境条件以及不定根的诱导条件等的优化筛选，建立一套高效的短萼仪花的组培快繁技术体系，不仅可实现外植体的多次利用，且对获得大量优良园林苗木，实现其种质资源的有效保护与利用具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，针对应用组培快繁技术培育短萼仪花的空白，提供一种短萼仪花的组培快繁方法。本发明选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高6m以上的优良单株为采种母树，采集无病虫害且成熟荚果作为研究材料，通过人工剥开果荚，选取种实饱满、无病虫害的种子为外植体，建立一套经济、高效的短萼仪花的组培快繁技术体系。该方法可实现外植体材料多次利用、丛芽增殖快、生根率高、植株生长健壮等优点，有效解决短萼仪花资源缺乏、种子吸水困难及发芽率低等问题，为获得大量优良园林苗木，实现其种质资源的有效保护与利用提供了一条重要的途径。
6.本发明的一种短萼仪花的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.s1.外植体采集：选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高6m以上的短萼仪花为采种母树，果荚采集后，装入通风塑料袋带回实验室，人工剥开果荚，选取种实饱满、无病虫害
的种子，备用。
8.s2.外植体表面消毒：在超净工作台上先将短萼仪花种子装进无菌组培瓶中，用无菌水冲洗3-5次，加入次氯酸钠原液浸泡消毒30min，其间不断摇动，倒出次氯酸钠原液后再用无菌水冲洗1～3次。
9.s3.种子浸种处理：将消毒好的种子用高温无菌水浸泡，直至温度降到50℃左右，再用保鲜膜包裹组培瓶转移至水浴锅继续恒温浸种5h。
10.s4.丛芽诱导：将处理好的种子播种于经过高温灭菌的装有3cm厚度河沙的组培瓶中先暗培养5d，然后转为常规培养，每瓶播种一粒种子。5～7d之后，种子脱壳开始萌动，一个月后幼苗可达到3～4cm高，然后剪取长度为2～3cm顶芽接种于添加了6-ba 0.2～0.5mg/l、iba 0.01～0.02mg/l、ga30.5～1.0mg/l、蔗糖25～30g/l、琼脂粉6g/l、ph为5.8～6.0的yh基本培养基进行丛芽诱导培养，将剪去顶芽的种子继续放置于培养架上进行常规培养。
11.所述的yh基本培养基均含有以下成分：
12.大量元素：825mg/lnh4no3；950mg/l kno3；660mg/l cacl2.2h2o；370mg/lmgso4.7h2o；170mg/l kh2po4。
13.有机：4mg/l甘氨酸；200mg/l肌醇；0.5mg/l盐酸硫胺素(vb1)；1.0mg/l盐酸吡哆醇(vb6)；2.5mg/l烟酸；0.24mg/l生物素；5mg/l l-半胱氨酸；2.4mg/l d-泛酸钙。
14.铁盐、微量元素：与ms基本培养基相同。
15.s5.丛芽增殖：将诱导出的丛芽转接到添加了6-ba 0.2～0.5mg/l、iba 0.01～0.02mg/l、蔗糖25～30g/l、琼脂粉6g/l、ph为5.8～6.0的yh基本培养基进行丛芽增殖培养，得到增殖苗。
16.s6.生根培养：从增殖苗中切取长度大于2cm的嫩芽转接至添加了iba 0.5～1.0mg/l、蔗糖15～20g/l、琼脂粉6g/l、ph为5.8～6.0的1/2yh基本培养基进行不定根诱导培养，得到组培生根苗；
17.s7.炼苗与移栽：将生根培养20d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗3d，将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝3：1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理。
18.作为优选地，步骤s1中所述的果荚采种时间为每年10月份，于晴朗干燥天气采集已成熟未开裂且无病虫害的果荚为实验材料，装入通风塑料袋带回实验室，人工剥开果荚，选取种实饱满、无病虫害的种子，备用。
19.作为优选地，步骤s2中所述的次氯酸钠原液为30％次氯酸钠溶液。
20.作为优选地，步骤s3中所述的浸种处理过程为：在超净工作台上，用85～100℃无菌水浸泡种子，直至温度降到50℃左右，再用保鲜膜包裹组培瓶(瓶子要用盖子密封)转移至恒温水浴锅50℃浸种5h。
21.作为优选地，所述的1/2yh基本培养基所含大量元素用量减半，其余成分不变。
22.作为优选地，所述的培养条件为：温度25
±
2℃，光照强度1500～2500lx，光照时间12h/d。
23.本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
24.①
采用次氯酸钠原液进行种子消毒处理，一方面可对短萼仪花种子表面进行较为彻底的灭菌，为无菌系的建立打下良好的基础；另一方面，次氯酸钠原液浓度较高，具有一
定的腐蚀性，可对坚硬的种皮腐蚀与软化，并结合高温无菌水浸种处理，能够有效促进种子吸水膨胀萌芽，提高种子发芽率及发芽速度。
25.②
将剪取顶芽后的外植体继续培养，利用种子胚乳自身储存的营养供给新芽生长，有效实现外植体材料多次利用，为下一步丛芽诱导与增殖培养提供大量的嫩芽。
26.③
本发明具有种子发芽率高、丛芽增殖快、增殖系数高、生根率高、植株生长健壮等优点，发芽率高达95.6％，增殖系数达4.63，生根率高达94.6％，移栽成活率高达92.0％，有效解决短萼仪花资源缺乏、种子吸水困难及发芽率低等问题，为获得大量优良园林苗木，实现其种质资源的有效保护与利用提供了一条重要的途径。
附图说明
27.图1为优良单株的种子图片。
28.图2为接种于丛芽诱导培养基(yh基本培养基+0.2～0.5mg/l 6-ba+0.01～0.02mg/liba+0.5～1.0mg/l ga3+25～30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为5.8～6.0)培养30d的丛芽诱导图片。
29.图3为在增殖培养基(yh基本培养基+0.2～0.5mg/l 6-ba+0.01～0.02mg/l iba+25～30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为5.8～6.0)培养35d后获得的增殖芽图片。
30.图4为在生根培养基(1/2yh基本培养基+0.5～1.0mg/l iba+15～20g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为5.8～6.0)培养30d后获得的生根图片。
具体实施方式
31.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所述技术领域的普通实验人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
32.实施例一：
33.s1.外植体采集：每年10月份果实成熟后，于晴朗干燥天气，选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高6m以上优良单株为采种母树，果荚采集后，装入通风塑料袋带回实验室，人工剥开果荚，选取种实饱满、无病虫害的种子，备用(如图1所示)。
34.s2.外植体表面消毒：在超净工作台上先将短萼仪花种子装进无菌组培瓶中，用无菌水冲洗3次，加入浓度为30％次氯酸钠原液浸泡消毒30min，其间不断摇动，倒出次氯酸钠原液后再用无菌水冲洗3次。
35.s3.种子浸种处理：将消毒好的种子用100℃无菌水浸泡，直至温度降到50℃，再用保鲜膜包裹组培瓶转移至水浴锅恒温50℃浸种5h。
36.s4.丛芽诱导：将处理好的种子播种于经过高温灭菌的装有3cm厚度河沙的组培瓶中先暗培养5d，然后转为常规培养，每瓶播种一粒种子。第5d后种子脱壳开始萌动，第12d后顶芽长至1cm左右，一个月后幼苗可达到3～4cm高，种子发芽率高达95.6％。然后剪取长度为2～3cm顶芽接种于丛芽诱导培养基(yh基本培养基+0.2mg/l 6-ba+0.01mg/l iba+0.5mg/lga3+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为6.0)进行培养，30d后获得大量的丛芽(如图2所示)。将剪去顶芽的种子继续放置于培养架上进行培养。培养条件为温度25
±
2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
37.s5.丛芽增殖：将诱导出的丛芽转接到增殖培养基(yh基本培养基+0.5mg/l 6-ba+0.01mg/l iba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为6.0)进行增殖培养。培养条件为温度25
±
2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。第35d后增殖芽生长健壮，增殖系数可达4.63(如图3所示)。
38.s6.生根培养：从增殖苗中切取长度大于2cm的嫩芽接种于生根培养基(1/2yh基本培养基+0.5mg/l iba+15g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为6.0)进行培养，第12d可见白色短根长出，30d生根率可达94.6％，根较粗长，植株生长健壮(如图4所示)。
39.s7.炼苗与移栽：将生根培养20d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗3d，将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝3：1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于92.0％。
40.实施例二：
41.s1.外植体采集：每年10月份果实成熟后，于晴朗干燥天气，选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高6m以上优良单株为采种母树，果荚采集后，装入通风塑料袋带回实验室，人工剥开果荚，选取种实饱满、无病虫害的种子，备用。
42.s2.外植体表面消毒：在超净工作台上先将短萼仪花种子装进无菌组培瓶中，用无菌水冲洗3次，加入浓度为30％次氯酸钠原液浸泡消毒30min，其间不断摇动，倒出次氯酸钠原液后再用无菌水冲洗3次。
43.s3.种子浸种处理：将消毒好的种子用85℃无菌水浸泡，直至温度降到50℃，再用保鲜膜包裹组培瓶转移至水浴锅恒温50℃浸种5h。
44.s4.丛芽诱导：将处理好的种子播种于经过高温灭菌的装有3cm厚度河沙的组培瓶中先暗培养5d，然后转为常规培养，每瓶播种一粒种子。第7d后，种子脱壳开始萌动，第12d后腋芽长至1cm左右，一个月后幼苗可达到3～4cm高，种子发芽率高达91.2％。然后剪取长度为2～3cm顶芽接种于丛芽诱导培养基(yh基本培养基+0.5mg/l 6-ba+0.02mg/l iba+1.0mg/l ga3+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为6.0)进行培养，将剪去顶芽的种子继续放置于培养架上进行培养。培养条件为温度25
±
2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。
45.s5.丛芽增殖：将诱导出的丛芽转接到增殖培养基(yh基本培养基+0.3mg/l 6-ba+0.02mg/l iba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为6.0)进行增殖培养。培养条件为温度25
±
2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。第35d后增殖芽生长健壮，增殖系数可达3.89。
46.s6.生根培养：从增殖苗中切取长度大于2cm的嫩芽接种于生根培养基(1/2yh基本培养基+1.0mg/l iba+15g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为6.0)进行培养，第12d可见白色短根长出，第30d生根率可达92.1％，根底部有少量愈伤，根较粗长，植株生长健壮。
47.s7.炼苗与移栽：将生根培养20d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境5d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗3d，将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝3：1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于88.6％。
48.实施例三：
49.s1.外植体采集：每年10月份，于晴朗干燥天气，选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高6m以上优良单株为采种母树，果荚采集后，装入通风塑料袋带回实验室，人工剥开
果荚，选取种实饱满、无病虫害的种子，备用。
50.s2.外植体表面消毒：在超净工作台上先将短萼仪花种子装进无菌组培瓶中，用无菌水冲洗3次，加入浓度为30％的次氯酸钠原液浸泡消毒30min，其间不断摇动，倒出次氯酸钠原液后再用无菌水冲洗3次。
51.s3.种子浸种处理：将消毒好的种子用90℃无菌水浸泡，直至温度降到50℃，再用保鲜膜包裹组培瓶转移至水浴锅恒温50℃浸种5h。
52.s4.丛芽诱导：将处理好的种子播种于经过高温灭菌的装有3cm厚度河沙的组培瓶中先暗培养5d，然后转为常规培养，每瓶播种一粒种子。第7d后，种子脱壳开始萌动，一个月后幼苗可达到3～4cm高，然后剪取长度为2～3cm顶芽分别接种于ms、wpm以及yh培养基进行培养，各个培养基添加的激素种类与浓度与实施案例一丛芽诱导阶段相同。培养条件为温度25
±
2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。第30d后观察丛芽的生长情况。
53.表1不同培养基对丛芽诱导效果的影响
[0054][0055]
s5.丛芽增殖：将诱导出的丛芽转接到ms、wpm以及yh增殖培养基进行增殖培养，各个培养基添加的激素种类与浓度与实施案例一丛芽增殖阶段相同。培养条件为温度25
±
2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。第35d后观察丛芽的增殖与生长情况。
[0056]
表2不同基本培养基对丛芽增殖效果的影响
[0057][0058]
s6.生根培养：从增殖苗中切取长度大于2cm的嫩芽转接至生根培养基(1/2yh基本培养基+1.0mg/l iba+15g/l蔗糖+6g/l琼脂粉；ph为6.0)进行培养，12d可见白色短根长出，30d生根率可达92.1％，根底部有少量愈伤，根较粗长，植株生长健壮。
[0059]
由表1、表2可以得出，不同基本培养基对短萼仪花丛芽诱导与增殖效果影响较大，从表3基本培养基成分对比可以分析出，在激素种类和浓度相同的条件下，ms基本培养基中nh4no3、kno3含量较高，或wpm基本培养基中nh4no3、kno3含量较低，均不利于组培苗的丛芽诱导与增殖，也直接影响了丛芽的生长状况。此外，本发明还通过对基本培养基有机成分的研究发现，适当添加甘氨酸、肌醇、生物素、l-半胱氨酸、d-泛酸钙等成分，能够有效促进丛芽萌发与生长。综上分析，以yh培养基的丛芽诱导效果最好，且丛芽增殖系数最大，高达4.63，丛生芽健壮整齐，为最佳丛芽诱导培养基与增殖培养基。
[0060]
表3基本培养基成分对比一览表(单位：mg/l)
[0061][0062]
s7.炼苗与移栽：将生根培养20d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境5d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗3d，将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝3：1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于89.5％。
[0063]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在发明的保护范围之内。