本发明属于细胞生物学，尤其涉及一种角膜内皮细胞超低温保存方法及其冷冻保护剂和应用。
背景技术：
1、在细胞研究和生产的各个领域，将细胞进行超低温保存是其中必不可少的操作，只有当细胞可以恢复到生理功能而细胞生存力和功能活性的损失不明显时，冷冻保存才能被认为是成功的。在整个冷冻-储存-解冻过程中，面临的一项关键性挑战是确保高细胞存活率，或许更重要的是确保超低温保存细胞操作的可预测性和重现性。为此，人们制定了许多不同的指导方针和方案。
2、就冷冻保护剂研究方面，目前，已有120多种属于不同种类化合物的物质被鉴定和测试为有前途的冷冻保护剂，包括醇(乙二醇、α-丙二醇、甘油)、酰胺(二甲基乙酰胺、尿素)、氧化物(二甲基亚砜)、碳水化合物(葡萄糖、蔗糖)、合成聚合物(聚乙烯吡咯烷酮、乙氧基化淀粉、聚乙二醇、聚环氧乙烷)、无机盐(氯化钠、氯化钾、氯化钙、柠檬酸钠、磷酸三钠、edta二钠盐)等。
3、除了几乎每个实验室都有内部冷冻保护剂配方外，还有市售的现成冷冻保护剂，一般来说，制造商是不会透露的全部配方的，但会部分公开，通常含有dmso，例如冷冻保护剂cs10含有10％的dmso。尽管存在各种各样的冷冻保护剂，但是新的和更有效的冷冻保护剂的开发仍在进行中。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种细胞超低温保存方法，有助于最大限度地保证人源角膜内皮细胞的冻存和解冻效果，进而提供一种人源角膜内皮细胞冷冻保护制剂，可用于满足临床级细胞需求、疾病建模和药物筛选等。
2、本发明的目的是提供一种角膜内皮细胞超低温保存方法，该方法所用细胞冷冻保护制剂毒性较低，对细胞的影响较温和，并且在解冻后的清洗过程中可以很容易地去除，细胞培养物解冻后可以保持较高的存活率，细胞在冷冻前和解冻后样品的生存力没有显著差异。该方法制备过程简单程序化，为细胞的规模化应用奠定基础，可用于满足临床级细胞需求、疾病建模和药物筛选等。
3、本发明提供了一种角膜内皮细胞的冷冻保护制剂，其含有1-20％(ml/ml)血清替代物，5-10％(ml/ml)二甲基亚砜(dmso)、2-6％(g/ml)羟乙基淀粉(hes)、2-6％(g/ml)硫酸软骨素，以人内皮无血清培养基为溶剂。
4、优选地，其含有10％(ml/ml)血清替代物，5％(ml/ml)二甲基亚砜(dmso)、6％(g/ml)羟乙基淀粉(hes)、2％(g/ml)硫酸软骨素，以人内皮无血清培养基为溶剂。
5、在一具体实施方案中，其组成成分包括：溶剂为人内皮无血清培养基，分别为(1～50)×105个细胞/ml的人源角膜内皮活细胞，10％(ml/ml)血清替代物，5％(ml/ml)二甲基亚砜(dmso)、6％(g/ml)羟乙基淀粉(hes)、2％(g/ml)硫酸软骨素。
6、本发明还提供了一种角膜内皮细胞超低温保存方法，所述方法包括如下步骤：
7、冻存步骤：角膜内皮细胞的冻存；
8、本发明中，所述角膜内皮细胞的冻存步骤，包括如下步骤：
9、第一步：将冻存细胞置于4℃冷藏冰箱15～30min；
10、第二步：将冻存细胞置于程序降温仪，以如下温度分步降温：
11、以-0.1℃/min持续稳定10min，终温度4.0℃；
12、以-1.0℃/min降温至-5.0℃；
13、以-2.8℃/min降温至-8.0℃，+5.2℃/min升至温度-3.0℃；
14、以-0.3℃/min降温至-4.0℃；
15、以-1.5℃/min降温至-6.0℃；
16、以-1.0℃/min降温至-40.0℃；
17、以-2.6℃/min降温至-80.0℃，维持30min；
18、第三步：将冻存细胞迅速转移并置于液氮中。
19、其中，所述冻存步骤中，所述冻存保护剂为如上所述的细胞冷冻保护剂。
20、其中，在所述冻存步骤之前，还包括：
21、细胞培养步骤：进行角膜内皮细胞的培养；
22、消化和筛选步骤：进行角膜内皮细胞的消化和筛选。
23、其中，在所述冻存步骤之后，还包括：
24、细胞复苏步骤：进行角膜内皮细胞的复苏。
25、在具体实施方案中，所述角膜内皮细胞超低温保存方法如下步骤：
26、(1)角膜内皮细胞的培养：取稳定增殖的角膜内皮细胞以不少于5000个细胞/cm2密度传代，置于37℃、5％co2条件下培养，每两天更换角膜内皮完全培养基。所述角膜内皮完全培养基的基础培养基人内皮无血清培养基，其中添加了2～10％血清替代物、25～100μg/ml的l-抗坏血酸-2-磷酸酯。
27、(2)角膜内皮细胞的消化和筛选：待角膜内皮细胞培养至80％以上汇合度，去除培养基，用dpbs缓冲溶液冲洗，然后用0.05％edta-0.125胰蛋白酶在37℃条件下孵育并消化细胞，收集悬浮细胞于dpbs缓冲溶液中；通过细胞计数仪对细胞活力计数，细胞活力不少于90％时进行后续操作。
28、(3)角膜内皮细胞的冻存：将上述悬浮细胞以500g离心5分钟，弃去上清并重悬于细胞冻存保护剂中，以(1～50)×105个细胞/ml、1ml/管分装，按照角膜内皮细胞冻存程序降温，并储存于液氮中。
29、所述冻存保护剂为：溶剂为人内皮无血清培养基，分别含有1-20％(ml/ml)血清替代物，5-10％(ml/ml)二甲基亚砜(dmso)、2-6％(g/ml)羟乙基淀粉(hes)、2-6％(g/ml)硫酸软骨素；优选地，溶剂为人内皮无血清培养基，分别含有10％(ml/ml)血清替代物，5％(ml/ml)二甲基亚砜(dmso)、6％(g/ml)羟乙基淀粉(hes)、2％(g/ml)硫酸软骨素。
30、本发明中，
31、％表示溶液百分比。
32、％(ml/ml)表示溶液100ml中含有溶质若干ml。
33、％(g/ml)表示溶液100ml中含有溶质若干g。
34、本发明所述角膜内皮细胞冻存步骤，操作步骤为：
35、第一步：将冻存细胞置于4℃冷藏冰箱15～30min；
36、第二步：将冻存细胞置于程序降温仪，以如下温度分部降温：以-0.1℃/min持续稳定10min，终温度4.0℃；以-1.0℃/min降温至-5.0℃；以-2.8℃/min降温至-8.0℃，+5.2℃/min升至温度-3.0℃；以-0.3℃/min降温至-4.0℃；以-1.5℃/min降温至-6.0℃；以-1.0℃/min降温至-40.0℃；以-2.6℃/min降温至-80.0℃，维持30min；
37、第三步：将冻存细胞迅速转移并置于液氮中。
38、(4)角膜内皮细胞的复苏：将上述冻存细胞置于37～42℃水浴中解冻，待少许冰冻且液体状态时，迅速转移至37℃生理盐水离心管中，以500g离心5分钟，并去除上清，并重悬于生理盐水2～8℃生理盐水中。
39、本发明还提供了所述角膜内皮细胞超低温保存方法及其冷冻制剂的应用，可用于满足临床级细胞需求、疾病建模和药物筛选等。
40、本发明提出的方法中，(1)本发明冷冻保存方案中，结合角膜内皮细胞的培养、消化、冷冻速率、冷冻保护制剂的组成和浓度、温度和冷冻保存、解冻的持续时间等一系列参数地有机组合，是本发明基于角膜内皮细胞的冷冻保存方案成功的关键因素。(2)基于冷冻保护制剂的工作原理：与细胞内外的水分子形成强键，这些键比水分子之间的键更强；降低盐浓度，从而最大限度地降低破坏细胞蛋白质结构的风险；与细胞膜的结构成分结合，保护它们免受冰晶的破坏。本发明针对角膜内皮细胞制备的冷冻保护制剂是能够有效地防止角膜内皮细胞遭受冷冻损伤，以及有效地确保它们在解冻时的生存能力。(3)本发明角膜内皮细胞的冷冻保护制剂采用细胞外冷冻保护剂与细胞内冷冻保护剂联合使用，这种低温保护剂的组合可以提高生物物体的存活率；而且它们对细胞的影响较温和，并且在解冻后的清洗过程中可以很容易地去除。二甲基亚砜对动物和人的活细胞具有良好的渗透能力，是一种细胞内冷冻保护剂，在冷冻过程中充分保护细胞免受损伤。羟乙基淀粉是一种高分子非渗透冻存保护剂，即细胞外冷冻保护剂，能够减少冰晶的形成以及防止细胞溶质损伤。(4)本发明在上述二甲基亚砜和羟乙基淀粉配合的基础上，加入了血清替代物和硫酸软骨素，可以进一步提升冻存细胞活力，并且延长细胞的冻存时间，可以进行规模化应用。
41、本发明有益效果包括：本发明方法技术方案简便，易操作。除了冷冻保护剂，冷冻保存方案通常是多阶段的，并且包括许多连续的步骤：冷冻保存的初步细胞准备、细胞冷冻、冷冻保存的控制和冷冻的基于细胞的产品的潜在运输，考虑到与特定温度方案的一致性、解冻和细胞的适应环境等。基于实验室不同的研究目标、材料、设备和试剂，每个阶段都允许许多修改，本发明创新开发了一个较佳的冷冻保存方案，进而使基于角膜内皮细胞的产品的质量达到一个较优水平。