RNAi纳米颗粒及其在农业中的使用方法

本发明属于农业组合物领域，特别是用于递送农业活性剂如基因沉默多核苷酸的制剂。

背景技术：

0、技术背景

1、rna干扰(rnai)是一种基因调控机制，也称为植物转录后基因沉默(ptgs)。这种机制是序列特异性的，因为它依赖于双链rna(dsrna)前体来触发该过程。在植物中，rnaseiii样酶(dicer样(dcl)蛋白)将dsrna加工成21-24个碱基对(bp)的短干扰rna(sirna)，其指导转录物识别和下游降解。与哺乳动物细胞不同，dcl蛋白优选加工长的dsrna前体，然后通过胞间连丝在植物细胞之间进行明显的sirna迁移，因此，rnai被认为可能成功地将系统抗性应用于植物病毒。为了利用rnai，dsrna需要通过递送途径进入细胞的细胞质。裸dsrna的叶面施用(foliar application，叶面施肥)危及其稳定性并导致短的沉默期，而标准递送方法(例如，农杆菌属和/或dna载体)具有其自身的局限性，例如抑制脱靶基因。

2、病毒性葡萄卷叶病(viral grapevine leafroll disease，gld)是需要用于递送基因沉默多核苷酸的农业上可接受的组合物的非限制性实例。古代和现代的葡萄酒产业在很大程度上依赖于健康的藤和优质的葡萄。近几十年来，gld通过降低作物产量和阻碍浆果质量指标(如簇大小、ph、糖水平和颜色)对全球葡萄酒生产构成重大威胁，从而导致重大经济影响。在与gld相关的各种病毒中，葡萄卷叶相关病毒3(grapevine leafrollassociated virus3，glrav-3)是最普遍和最严重的菌株，其引起强烈的疾病症状，并降低植物活力和寿命。在新西兰，glrav-3强烈延迟了长相思浆果(sauvignon blanc berries)的成熟的开始，并降低了其可滴定酸度。在美国密歇根州本顿港(benton harbor,michigan,usa)，与健康藤相比，受感染的品丽珠品种(cabernet franc cultivar)的每藤葡萄产量和可溶性固体含量受到损害。glrav-3属于葡萄卷叶病毒属(ampelovirusgenus)，由螺旋单部分(monopartite)、正义、单链rna基因组组成，大小近18.5kb。它包括12个开放阅读框，分别编码复制和结构相关蛋白，如rna依赖性rna聚合酶(rdrp)和外壳蛋白(cp)，以及其它必需蛋白。尽管实施了管理gld的实际策略，通过控制粉蚧媒介(mealybugvector)以及上至提供经认证的种植材料来记录、绘制和根除受感染的藤，但考虑到控制病毒传播和分布的挑战，大多数策略均无效。

3、仍然非常需要新的技术方法来以农业上可接受的形式递送多核苷酸(例如，基因沉默多核苷酸)。

技术实现思路

1、在一些实施方式中，本发明涉及用于基于聚阳离子纳米颗粒(np)的长dsrna的递送平台。

2、本发明部分地基于以下发现：本文所述的dsrna-pei np在叶面施用后的连续田间试验中实现了病原体(致病因子，pathogenic agent)(例如glrav-3)的敲低。

3、本发明还部分地基于以下发现：本文所述np的合成是容易、快速和可扩展的，从而在环境条件下产生稳定的np。

4、本发明还部分地基于以下发现：本文提供的np提供了通过叶(例如，葡萄藤叶)运输系统的被动递送以及防止核酸酶降解的序列保护。

5、因此，在一些实施方式中，本发明公开了基于脂质修饰的聚乙烯亚胺(lmpei)np的长dsrna的递送平台，用于有效系统治疗病毒感染，包括但不限于由glrav-3诱导的gld。

6、根据第一方面，提供了纳米颗粒，包括:(a)两亲性共聚物，其包括共价结合至疏水结构域的可电离聚合物；和(b)包括60至500个核碱基(nucleobases)的多核苷酸；

7、其中可电离聚合物包括胺基；其中纳米颗粒内的氮与磷酸根(phosphate)(n:p)摩尔比的范围为2:1至7:1，其中多核苷酸与可电离聚合物非共价结合，并且其中疏水结构域包括烷基链，其长度足以使纳米颗粒在水溶液中稳定至少1小时的时间段。

8、根据另一方面，提供了包括本文公开的多个纳米颗粒和农业上可接受的载体的组合物。

9、根据另一方面，提供了将多核苷酸引入植物的方法，该方法包括将植物或其部分与治疗有效量的以下物质接触:(a)本文公开的纳米颗粒；或(b)本文公开的组合物，从而将多核苷酸引入植物。

10、根据另一方面，提供了用于预防或治疗植物中病毒性传染病的方法，该方法包括将植物或其部分与治疗有效量的以下物质接触:(a)本文公开的纳米颗粒；或(b)本文公开的组合物，从而预防或治疗植物中的病毒性传染病。

11、在一些实施方式中，烷基链包括10至14个碳原子。

12、在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸(颗粒大小，粒径，particle size)在100nm和500nm之间。

13、在一些实施方式中，纳米颗粒的颗粒尺寸在150nm和350nm之间。

14、在一些实施方式中，胺基是伯胺基、仲胺基、叔胺基或其任何组合中的任何一种。

15、在一些实施方式中，可电离聚合物是聚乙烯亚胺(pei)。

16、在一些实施方式中，pei包括分枝pei。

17、在一些实施方式中，分枝pei包括分枝烷基化pei。

18、在一些实施方式中，分枝烷基化pei包括至多12个碳原子的烷基链。

19、在一些实施方式中，纳米颗粒还包括生物活性剂。

20、在一些实施方式中，非共价结合是静电结合。

21、在一些实施方式中，多核苷酸包括100至350个核碱基。

22、在一些实施方式中，多核苷酸包括多种多核苷酸类型。

23、在一些实施方式中，多核苷酸包括rna。

24、在一些实施方式中，rna包括双链rna(dsrna)。

25、在一些实施方式中，rna与以下任一种具有至少70％的互补性：(i)源自病原体的至少一种rna分子；和(ii)源自植物细胞的至少一种rna分子。

26、在一些实施方式中，病原体是植物病原体。

27、在一些实施方式中，病原体是病毒。

28、在一些实施方式中，多个纳米颗粒的特征在于多分散指数(pdi)范围为1至1.5。

29、在一些实施方式中，多个纳米颗粒的特征在于平均ζ电位的范围为-5mv至40mv。

30、在一些实施方式中，载体选自：溶剂、表面活性剂、分散剂、粘接剂、铺展剂(spreading agent)、增效剂、渗透剂、相容剂、缓冲液、消泡剂、增稠剂、抗漂移剂及其任何组合。

31、在一些实施方式中，通过喷洒、浸润、浸渍、浸泡、注射或其任何组合来配制组合物以供施用。

32、在一些实施方式中，病毒性传染病包括葡萄卷叶病(grapevine leafrolldisease)(gld)。

33、在一些实施方式中，病毒性疾病由属于葡萄卷叶病毒属的病毒诱导。

34、在一些实施方式中，病毒性疾病由选自葡萄卷叶相关病毒(glrav)的病毒诱导。

35、在一些实施方式中，病毒性疾病由病毒glrav-3诱导。

36、在一些实施方式中，治疗包括降低在植物或其部分中诱导病毒性传染病的病毒的滴度。

37、在一些实施方式中，治疗包括降低植物卷曲叶子的数量、植物叶子向下卷曲或呈杯状(cupping)的比率及其组合中的任何一种。

38、在一些实施方式中，接触包括对植物或其部分进行喷洒、浸润、浸渍、浸泡、注射或其任何组合。

39、在一些实施方式中，植物部分包括植物的叶。

40、除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可以在本发明实施方式的实践或测试中使用与本文所述类似或等效的方法和材料，但下面描述示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，不一定是限制性的。

41、从下文给出的详细描述中，本发明的进一步实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应该理解的是，虽然指示本发明的优选实施方式，但详细描述和具体实例仅通过示例给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将从该详细描述中变得显而易见。