一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法

本发明涉及生物，具体涉及一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。

背景技术：

1、传统育种方法育成一个优良小麦品种至少需要8-10年，而单倍体育种采用孤雌生殖或雄核发育产生单倍体，经过加倍后直接产生纯合双单倍体，经过一次培养或诱导就能产生全部基因同质的纯合二倍体，繁殖种子后就可参加产量鉴定和适应性试验，大大缩短了育种周期，提高了育种效率。

2、小麦单倍体最早主要通过花药培养和小孢子培养诱导产生，但花药培养和小孢子培养存在强烈的基因型依赖性和严重的白化苗现象，大多数基因型或杂种组合不能通过花药培养和小孢子培养获得再生植株，育种群体难以形成规模。另外，花药培养和小孢子培养诱导单倍体的程序比较复杂，要求一定的实验设备和条件。上世纪80年代末期发现，小麦与玉米杂交后玉米染色体逐步从合子胚中消失，产生无胚乳发育的小麦单倍体胚籽粒，经过幼胚拯救培养可以获得小麦单倍体植株。小麦与玉米杂交诱导小麦单倍体技术受环境条件和实验设施的影响较大，单倍体胚和单倍体植株诱导效率较低，应用范围受到限制。

3、近年来利用基因编辑技术敲除mtl(pla)基因、dmp基因，pld3基因等可以有效的诱导母本单倍体，中国农业大学陈绍江教授团队利用crispr/cas9技术编辑小麦中zmmtl基因的同源基因tapla，获得了同时敲除tapla-a和tapla-d的突变体，单倍体诱导率为2-3％(liu et al.,2020a)。目前有研究在优化利用crispr/cas9编辑小麦基因技术体系的基础上，编辑小麦中zmmtl基因的同源基因tamtl，获得了mtl-a、mtl-ad、mtl-bd和mtl-abd共4种类型纯合突变体，其中3个等位基因同时突变的mtl-abd自交后代中单倍体诱导率为18.9％。

4、单倍体在植株水平可以利用细胞学、细胞遗传学、基因组学和形态学等方法进行鉴定，包括保卫细胞长度、染色体数目、dna总量、基因拷贝数、花粉活性、植株高度和育性等。通过花药培养、小孢子培养和远缘杂交等技术诱导产生的植株几乎全部为单倍体。但通过crispr/cas9技术编辑mtl基因或诱导系授粉产生的单倍体胚，其频率只有1-20％，需要在籽粒发育阶段辨别单倍体和二倍体，以便进行染色体加倍。

5、小麦单倍体在植株水平可以利用细胞学、细胞遗传学、基因组学和形态学等方法进行鉴定，包括保卫细胞长度、染色体数目、dna总量、流式细胞倍性、基因拷贝数和植株高度等。通过花药培养、子房培养和远缘杂交等技术诱导产生的小麦植株几乎全部为单倍体，可以全部直接进行染色体加倍处理获得纯合二倍体植株。但是，通过crispr/cas9技术敲除tamtl基因创制的小麦单倍体诱导系与其它品种杂交后的籽粒中既有单倍体又有二倍体，他们在外观形态上没有差异。由于源于tamtl基因敲除诱导系诱导小麦单倍体的频率还比较低，从育种角度出发，需要尽可能在早期大量、快速、准确鉴定出单倍体，以便对单倍体及时进行染色体加倍。然而，在目前鉴定小麦单倍体的几种方法中，有的方法操作复杂、费时、需要特殊仪器设备，有的方法需要较多样品或在植株生长到足够大时才能进行，不适用于幼苗萌发阶段对单倍体进行大规模鉴定，急需开发一种对利用crispr/cas9技术敲除小麦tamtl基因创制的单倍体诱导系诱导的单倍体进行快速、准确的鉴定方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。

2、第一方面，本发明提供了一种鉴别或辅助鉴别植物单倍体诱导系的诱导后代中单倍体的方法，包括如下步骤：

3、1)创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系；

4、所述创制的方法为将可视化标记基因及驱动其表达的启动子转移到植物单倍体纯合诱导系中，得到表达可视化标记基因的单倍体诱导系；

5、所述启动子为胚芽鞘特异启动子或胚特异启动子；

6、2)将所述表达可视化标记基因的单倍体诱导系与植物其他品种杂交，得到f1代籽粒；

7、3)在所述f1代籽粒的萌发阶段通过胚芽鞘颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别；

8、或在所述f1代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别。

9、上文所述方法中，所述在f1代籽粒的萌发阶段通过胚芽鞘颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别为选取胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒，培育，得到或候选得到单倍体小麦。

10、或，所述在f1代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别为选取胚不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒，培育，得到或候选得到单倍体小麦。

11、上文所述方法中，所述植物为小麦、玉米、水稻、大麦、谷子、番茄或拟南芥。

12、上文所述方法中，所述植物单倍体纯合诱导系为对植物基因组中单倍体诱导基因进行基因编辑，使其终止表达或突变，得到纯合单倍体诱导系。

13、上文所述方法中，所述植物为小麦，

14、所述单倍体诱导基因为mtl同源基因或其他单倍体诱导基因；

15、所述其他单倍体诱导基因为pld3或dmp基因。

16、上文所述方法中，所述小麦的单倍体诱导基因tamtl-4a、tamtl-4b、tamtl-4d和/或诱导产生单倍体的其他tamtl基因。

17、上文所述方法中，所述可视化标记基因为zmc1和/或zmr基因；

18、所述胚芽鞘特异启动子为ubiquitin启动子；

19、所胚特异启动子为pbd；

20、或，所述可视化标记基因为zmc1基因，其对应的特异启动子为ubiquitin启动子，对应选取胚芽鞘为非紫色的f1代籽粒；

21、或，所述可视化标记基因为zmc1和zmr基因，其对应的特异启动子pbd，对应选取胚为非紫色的f1代籽粒。

22、上文所述方法中，所述创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系的方法为将表达可视化标记基因及驱动其表达的启动子的转基因株系与小麦单倍体纯合诱导系mtl-abd杂交，得到f1代植株，再将所述f1代植株自交后得到f2代籽粒或植株，选取具有可视化标记基因对应颜色的f2代籽粒或植株，对其进行可视化标记基因、tamtl-4a、tamtl-4b和tamtl-4d基因的鉴定，选取满足如下1)和2)，或，1)和3)条件的株系，记作表达可视化标记基因的单倍体诱导系；

23、1)、可视化标记基因纯合(如zmc1或zmc1和zmr基因)；

24、2)、tamtl-4a基因纯合、tamtl-4b基因纯合和tamtl-4d基因纯合；

25、3)、tamtl-4b基因纯合和tamtl-4d基因纯合。

26、具体如下：

27、所述创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系的方法包括如下a或b：

28、a所示的方法，包括如下步骤：

29、a-1)将表达可视化标记基因zmc1及其启动子的转基因株系与小麦单倍体纯合诱导系mtl-abd杂交，到f1代植株，从所述f1代植株收获f2代籽粒，选取具有紫色胚芽鞘f2代籽粒培育得到f2代植株；

30、a-2)对所述f2代植株进行zmc1基因、tamtl-4a基因、tamtl-4b基因和tamtl-4d基因鉴定，选取含有zmc1基因、tamtl-4b基因纯合和tamtl-4d基因纯合的f2代植株，记作含有zmc1基因的mtl-bd纯合突变体；

31、a-3)将所述含有zmc1基因的mtl-bd纯合突变体收获籽粒，按照株系种植，得到f2-3代植株，从所述f2-3代植株中选取zmc1基因不分离的植株，该zmc1基因不分离的f2-3代植株或其对应的含有zmc1基因的mtl-bd纯合突变体植株f2代株系记作zmc1基因纯合的mtl-bd纯合突变体，即为表达可视化标记基因的单倍体诱导系；

32、上述具有可视化标记基因zmc1对应胚芽鞘颜色为紫色，不具有可视化标记基因zmc1对应颜色为绿色；

33、b所示的方法，包括如下步骤：

34、b-1)将表达可视化标记基因zmr和zmc1及其启动子的转基因株系与所述小麦单倍体诱导系mtl-abd杂交，到f1代植株，从所述f1代植株收获f2代籽粒，选取紫色f2代籽粒培育得到f2代植株；

35、b-2)对所述f2代植株进行zmr基因、tamtl-4a基因、tamtl-4b基因和tamtl-4d基因鉴定，选取含有zmr基因、tamtl-4a基因基因纯合、tamtl-4b基因纯合和tamtl-4d基因纯合的f2代植株，记作含有zmr基因的mtl-abd纯合突变体；

36、b-3)将所述含有zmr基因的mtl-abd纯合突变体收获籽粒，按照株系种植，得到f2-3代植株，从所述f2-3代植株中选取zmc1和zmr基因不分离的植株，该zmc1和zmr基因不分离的f2-3代植株或其对应的含有zmc1和zmr基因的mtl-abd纯合突变体植株f2代株系记作zmc1和zmr基因纯合的mtl-abd纯合突变体，即为表达可视化标记基因的单倍体诱导系。

37、上述具有可视化标记基因zmr和zmc1对应颜色为紫色，不具有可视化标记基因zmc1对应颜色为白色。

38、上述选取含有zmc1基因的方法为如下zmc1基因鉴定；

39、上述选取含有zmr基因的方法为如下zmr基因鉴定；

40、上述选取tamtl-4a基因纯合的方法为如下tamtl-4a基因鉴定，再用tamtl-4a基因鉴定后的产物测序确定是否纯合；

41、上述选取tamtl-4b基因纯合的方法为如下tamtl-4b基因鉴定，再用tamtl-4b基因鉴定后的产物测序确定是否纯合；

42、上述选取tamtl-4d基因纯合的方法为如下tamtl-4d基因鉴定，再用tamtl-4d基因鉴定后的产物测序确定是否纯合；

43、所述zmc1基因鉴定采用pcr的方法，所用引物对由seq id no：1所示引物和seq idno：2所示引物组成；

44、所述zmr基因鉴定采用pcr的方法，所用引物对由seq id no：9所示引物和seq idno：10所示引物组成；

45、所述tamtl-4a基因鉴定采用pcr的方法，所用引物对由seq id no：3所示引物和seq id no：4所示引物组成；

46、所述tamtl-4b基因鉴定采用pcr的方法，所用引物对由seq id no：5所示引物和seq id no：6所示引物组成；

47、所述tamtl-4d基因鉴定鉴定采用pcr/re的方法，所用引物对由seq id no：7所示引物和seq id no：8所示引物组成，所述限制性内切酶为psti。

48、上述从f2-3代植株中选取zmc1基因不分离的植株为选取胚芽鞘均为紫色植株；

49、上述从f2-3代植株中选取zmr和zmc1基因不分离的植株为选取胚均为紫色植株。

50、上文第一方面的方法具体如下：

51、(1)利用含有zmc1基因的株系al-30与小麦纯合突变体mtl-abd杂交，从f2-3代分离群体中筛选含有zmc1基因的mtl-bd纯合突变体植株，并以此为父本获得杂交f1代籽粒，萌发后，通过幼苗胚芽鞘的颜色鉴别单倍体：具有紫色胚芽鞘的幼苗为二倍体杂交种，具有绿色胚芽鞘的幼苗为诱导出的单倍体。

52、其原理是：杂交f1代中的二倍体由编辑突变体雄配子与其他材料雌配子的合子发育而来，其幼苗基因组的一半来自父本(含有zmc1基因)，另外一半来自母本小麦材料，因此幼苗胚芽鞘部位呈紫色；杂交种中的单倍体由母本小麦材料的雌配子发育而来(作为诱导系的编辑突变体的染色体在合子细胞中被完全排除)，其幼苗基因组完全来源于母本小麦材料(不含有zmc1基因)，所以幼苗胚芽鞘部位呈绿色，因此可以通过幼苗胚芽鞘部位颜色直接快速的鉴定出单倍体。通过根尖染色体计数法证实该方法可行，适用于大批量单倍体幼苗的快速鉴定。

53、(2)利用胚和糊粉层特异性表达的双向启动子，驱动玉米花青素基因zmr基因和zmc1基因表达，获得的紫胚植株与获得的小麦mtl-abd纯合突变体进行杂交，并对杂交f2和f2-3代进行鉴定，获得含有zmr基因和zmc1基因的mtl-abd纯合突变体，以此为父本获得杂交f1代籽粒，通过籽粒胚部位颜色快速鉴定出单倍体籽粒。

54、其原理是：杂交种的二倍体由编辑突变体雄配子与其他材料雌配子的合子发育而来，其幼苗基因组的一半来自父本(含有zmr基因和zmc1基因)，另外一半来自母本小麦材料，因此籽粒胚部位呈紫色；杂交种中的单倍体由母本小麦材料的雌配子发育而来(作为诱导系的编辑突变体的染色体在合子细胞中被完全排除)，其幼苗基因组完全来源于母本小麦材料(不含有zmr基因和zmc1基因)，所以籽粒胚部位呈白色，因此可以通过籽粒胚部位颜色直接快速的鉴定出单倍体。通过根尖染色体计数法证实该方法可行，适用于大批量单倍体籽粒的快速鉴定。

55、第二个方面，本发明提供了第一个方面获得的胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒或植株在单倍体加倍育种中的应用；

56、或本发明提供了第一个方面获得的胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒或植株在单倍体加倍育种中的应用。

57、第三个方面，本发明提供了小麦的育种方法，为方法甲或乙：

58、所述方法甲包括如下步骤：选取第一个方面胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒或植株进行育种；

59、所述方法乙包括如下步骤：选取第一个方面胚不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒或植株进行育种。

60、上述育种为用胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒或胚不具有可视化标记基因对应颜色的f1代籽粒作为单倍体，经加倍产生纯合的后代，用作育种。

61、上述玉米zmc1和zmr基因分别属于myb和bhlh转录因子家族，参与调控玉米花青素的生物合成。

62、本发明可用于小麦tamtl纯合编辑突变体作为父本与其他小麦材料作为母本杂交诱导的单倍体籽粒的快速鉴定，对小麦单倍体育种、dh群体构建、基因定位和目标基因功能研究等具有重要意义。