一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法与流程

本发明涉及短柱油茶繁殖，尤其涉及一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法。

背景技术：

1、威宁短柱油茶，是贵州省特有的油茶物种，仅分布在威宁县海拔1700m至2600m区域，它具有耐寒、抗旱、含油率高等特性，既是优良的粮油树种，也是优美的观赏树种，同时具有油质好等优良经济性状，是贵州高寒山区发展林业产业的一条重要途径。

2、目前，油茶种苗繁育主要采用芽苗砧嫁接育苗，但芽苗砧嫁接育苗出圃时间长，而且受育苗季节的限制，而通过油茶穗条快繁，可以进行快速育苗、提高育苗效率和保持优良品种的性状。油茶穗条快繁有通过种胚进行组培快速育苗的方法，但这种方法不能保持优良品种的性状；也有利用叶片进行组培再生的研究，但是叶片愈伤组织的诱导率较低，分化率很低，不能满足工厂化育苗的要求。因此现有技术主要是利用带芽枝条进行穗条快繁，但枝条培养容易消毒不彻底，存在污染率较高的问题，同时由于污染率的问题，在培养过程中外植体会受到细菌和病毒的侵害导致死亡，导致繁殖系数很低，而利用枝条培育时，短柱油茶由于枝条外层有一圈连续排列的厚壁细胞进行保护，分化的芽难以突破冲出表层，这导致了枝条培养分化出的芽较少，再加上污染的问题，会导致最终培养的穗条数量达不到理想要求。

3、因此需要寻找在保证穗条污染率低的前提下，使威宁短柱油茶的分化出的丛芽数增多的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，以解决威宁短柱油茶在穗条快繁过程中外植体污染率较高和丛芽数较少的问题。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，包括以下步骤：

4、(1)外植体的选择：在3-4月份选取生长健壮、无病虫害的威宁短柱油茶的幼嫩带芽枝条作为外植体；

5、(2)芽诱导阶段：将外植体保湿带回实验室水培并进行消毒，用镊子将消毒后的外植体切成0.4-0.6cm的小段，接种到芽诱导培养基上，待芽生长高度达到2㎝时，在茎两端涂抹诱导液，进行转接进行增殖培养；

6、(3)增殖培养阶段：利用诱导出的小芽接种在增殖培养基上培养，形成芽的丛生植株；

7、(4)穗条采集及保存：选择增殖培养阶段培养出的优质粗壮、生长健康的高度在2㎝以上的无菌芽，剪去基部愈伤组织，清洗掉培养基后将穗条用洗毛巾包裹保存。

8、进一步，所述步骤(2)中的具体消毒步骤为：用质量分数0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体3次，每天1次，最后再把带芽枝条外植体用质量浓度0.1％升汞处理6-8分钟，体积分数70％的酒精处理30-60s,用无菌水清洗2-3次，当然地，本发明公开的消毒步骤还可以为将采集的带芽枝条剪掉叶片，留约0.3cm叶柄，用自来水冲洗30min；在超净工作台上用质量浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3-5次；然后用质量浓度0.1％的升汞浸泡杀菌10min，期间轻微晃动瓶子，再用无菌水冲洗8-10遍。

9、进一步，所述步骤(2)中诱导液包括以下原料：12-18质量份异麦芽酮糖、1-2质量份120g/l的天然脂肪醇、2-5质量份20μmol/l茉莉酸甲酯、0.5-1质量份甲羟戊酸、0.1-0.7质量份槲皮素、55-75质量份丙酮。

10、进一步，所述步骤(2)中诱导液的制备步骤如下：

11、称取异麦芽酮糖、天然脂肪醇、茉莉酸甲酯、甲羟戊酸、槲皮素溶于丙酮溶液中进行搅拌，混合均匀制得诱导液。

12、诱导液中的甲羟戊酸的加入能够促进赤霉素的合成，提高植物体内赤霉素的含量，槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，它可以激活赤霉素在植物体内运输到侧芽的信号通路，使甲羟戊酸促进合成的赤霉素作用到侧芽，即甲羟戊酸与槲皮素协同作用促进侧芽萌发和不定芽产生，有效的刺激植株再生，提高侧芽萌发分化的概率。但是侧芽的过快过多生长可能会消耗外植体体内大量营养物质，植物的供给无法跟上，会导致侧芽生长发育不良甚至导致外植体死亡；天然脂肪醇通过脱水作用破坏组织的防水层，进而破坏细胞，进一步抑制两端可能萌发的主芽，使得外植体体内的生长素减少极性运输，从而运输到侧端，使侧芽生长素浓度升高，加快侧芽的生长，同时天然脂肪醇是植物体内自主合成的天然有机物，待侧芽生长起来后且能显著增大芽叶面积，明显提高外植体的还原糖、总糖含量，而总植物碱、总氮及钾含量也不受影响，使芽叶发育良好。

13、异麦芽酮糖能诱导薄壁细胞加快分化为芽，使分化出的芽挤破阻碍生根的厚壁细胞层，使得侧芽能够顺利萌发，同时也能为外植体提供营养物质，而茉莉酸甲酯诱导蛋白酶抑制剂和多酚氧化酶反应，加快枝条对诱导液的吸收，还能增加过氧化物酶、壳聚糖酶和脂氧合酶等防御蛋白的活性水平,导致生物碱和酚酸类次生物质的积累，增加并改变挥发性信号化合物的释放,形成防御结构,减少细菌和病原体的侵入。同时槲皮素作为一种黄酮类物质具有一定的消炎杀菌作用，减少枝条在穗条快繁过程中的污染率问题。

14、进一步，所述步骤(2)中芽诱导培养基为ms+噻苯隆0.5mg/l+naa0.1mg/l+6-ba0.01mg/l的培养基，其中噻苯隆作为一种新型高效的细胞分裂素能更好的促进威宁短柱油茶的芽分化。

15、进一步，所述步骤(3)中芽诱导培养时，实验室温度为25±0.2℃，光照1000-2000lux,芽诱导培养基ph为6-7。

16、进一步，所述步骤(3)中增殖培养基为ms+6-ba0.1mg/l+naa0.1mg/l。

17、进一步，所述步骤(3)中增殖培养时，实验室温度为25±0.2℃，光照1000-2000lux，增殖培养基的ph为6-7，增殖培养的培养周期为22-25天。

18、进一步，所述步骤(3)中芽的丛生植株中，带芽生长高度在5㎝以上时，作为嫁接或扦插穗条利用，其嫁接或扦插步骤与普通方法繁殖出来的威宁短柱油茶穗条操作方法相同。

19、有益效果：

20、1、本发明通过优化外植体消毒处理和腋芽诱导、继代增殖培养基配方，能在短时间内获得大量长势良好的威宁短柱油茶组培苗，大大提高了增殖系数，良品率高。

21、2、通过本发明易于操作的穗条快繁方法，提高了繁殖速度，能在短时间获得品相高度一致的优质穗条，并提高性状稳定性，降低育苗成本，便于大规模的工厂化无性系嫁接，不受时间和季节的限制，也对威宁短柱油茶种质资源离体保存具有重要意义。

22、说明书附图

23、图1：实验组1的芽诱导培养图；

24、图2：实验组1的芽增殖培养图。

技术特征：

1.一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，快繁方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中的具体消毒步骤为：用质量分数0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体3次，每天1次，最后再把带芽枝条外植体用0.1％升汞处理6-8分钟，体积分数70％的酒精处理30-60s,用无菌水清洗2-3次。

3.根据权利要求2所述的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中诱导液包括以下原料：12-18质量份异麦芽酮糖、1-2质量份120g/l的天然脂肪醇、2-5质量份20μmol/l茉莉酸甲酯、0.5-1质量份甲羟戊酸、0.1-0.7质量份槲皮素、55-75质量份丙酮。

4.根据权利要求3所述的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中诱导液的制备步骤如下：

5.根据权利要求4所述的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中芽诱导培养基为ms+噻苯隆0.5mg/l+naa 0.1mg/l+6-ba0.01mg/l。

6.根据权利要求5所述的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(4)中增殖培养基为ms+6-ba 0.1mg/l+naa 0.1mg/l。

7.根据权利要求5所述的一种一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中芽诱导培养时，实验室温度为25±0.2℃，光照1000-2000lux,芽诱导培养基ph为6-7。

8.根据权利要求6所述的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中增殖培养时，实验室温度为25±0.2℃，光照1000-2000lux，增殖培养基的ph为6-7，增殖培养的培养周期为22-25天。

9.根据权利要求1所述的一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中芽的丛生植株中，带芽生长高度5㎝以上时，作为嫁接或扦插穗条利用。

技术总结
本发明公开了一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法，属于短柱油茶繁殖技术领域，以短柱油茶的带芽枝条为原料制备外植体，通过外植体的选择、芽诱导阶段、增殖培养阶段、穗条采集及保存，可以在制备品相高度一致的优质穗条，并且能提高性状稳定性。以枝条作为外植体培养穗条污染率较高，威宁短柱油茶本身是一种难生根物质，分化难度大。通过优化外植体消毒处理和腋芽诱导、芽增殖培养基配方，能在短时间内获得大量长势良好和性状一致的威宁短柱油茶穗条，可保持亲本的优良性状，因此通过组培繁殖穗条可满足芽苗砧嫁接容器苗的培育和扦插，大大提高了增殖系数，良品率高，有利于工厂化生产。

技术研发人员：田怀,王港,徐嘉娟,刘晓红,朱亚艳,霍达
受保护的技术使用者：贵州省林业学校（贵州省林业干部学校）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12