枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的方法

本发明涉及一种通过改良嫁接技术快速实现枸杞遗传物质水平转移至番茄并获得番茄再生的不定根的方法。通过生物信息学定位，特异性的在番茄中筛选出枸杞的dna片段，明确了番茄嫁接区域再生的不定根为转化根。具有转化根的番茄植物根系活力好，生长势强，长季节生长，实现了木本与草本不同物种间的优势互补，对提升番茄等蔬菜作物的产量、品质、抗性等都具有重要的意义。

背景技术：

1、水平基因转移可以定义为通过受精以外的方式进行的跨物种遗传物质传递，随着测序水平和生物信息学分析水平的进步，在植物基因组中发现水平基因转移的频率越来越高。对植物而言，水平基因转移通过相互接触的介导载体，包括共生、内共生、寄生、嫁接、附生等，直接进行遗传物质的交流；还涉及到病毒、细菌、真菌、昆虫(蚜虫)、线虫、花粉粒、转座元件等间接接触的中间载体。嫁接介导的水平基因转移现象最早是在烟草中观察到的，近年来，嫁接介导的水平基因转移事件会密切在相关物种之间发生，例如茄科植物烟草种内在嫁接结合部位存在着线粒体基因组片段、完整的叶绿体基因组以及整个核基因组水平基因转移的现象。水平基因的转移为农作物人工定向改良提供了一条崭新的途径。

2、茄科植物番茄(solanum lycopersicum)为世界第一大果实类蔬菜，植株顶端具有不断向上生长和开花结果的能力，营养生长和生殖生长同时进行，适合高效高产的长季节栽培。而番茄的地下根却容易受冬春季低温弱光/夏秋季高温高湿、土传病害危害、连作障碍等因素影响，引起根系活力下降和早衰，严重制约地上部分产量和品质的提升。因此，针对当前番茄植株抗逆性差、根系早衰以及改善设施栽培环境成本高等问题，番茄根系性状的改良迫在眉睫。

3、同属茄科植物的枸杞(lycium chinense miller.)与草本植物番茄相比，枸杞根系发达，为多年生，由于生长于干旱荒漠地带，根系具有抗旱、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠等极强的抗逆性，同时枸杞果实营养极其丰富，因此是改善番茄植株抗逆性差、根系早衰等问题合适的亲本材料。然而，枸杞与番茄亲缘关系较远，远缘杂交、细胞融合等都很困难。因此，通过降低枸杞细胞木质素含量建立高效嫁接体系的基础上，建立枸杞与番茄细胞间水平基因转移的技术体系，通过研究番茄不定根的诱导方法，获得枸杞遗传物质发生转化的番茄转化根，是解决当前番茄强根生物育种的一条有效途径。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，建立一种高效的枸杞与番茄细胞之间的水平基因转移体及其转化根获得的方法，首先需要通过降低枸杞细胞木质素含量，消除远缘嫁接细胞之间隔离层，使两个物种嫁接细胞连通，并通过对番茄接穗进行不同生长素处理，在番茄嫁接区域诱导出不定根。通过形态学与分子生物学分析，证明了嫁接介导的枸杞与番茄细胞之间发生了水平基因转移，诱导的不定根为枸杞水平基因转移到番茄的转化根。本发明建立了枸杞基因向番茄高效转移的技术体系并获得了转化根，实现了草本植物与木本植物遗传资源的优势互补。具有转化根系的番茄植株根系的活力好，植株生长势强，生长周期长，番茄的产量、品质、抗性等都得到了提升。

2、本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：

3、一种枸杞与番茄水平基因转移体系建立及转化根获得的方法，包括如下步骤：

4、(1)选取木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗作为砧木；木质素含量低于500s/g；

5、(2)选取生长至3叶1心番茄苗，将番茄苗距子叶0.5cm处的上胚轴切下，利用外源生长素进行处理5min，从上胚轴底部沿中心线对称切割两刀，使切好的番茄上宽下窄呈楔形，作为嫁接接穗与枸杞砧木进行嫁接建立枸杞与番茄高效嫁接体系，诱导番茄嫁接区域再生不定根。

6、(3)观察番茄嫁接区域不定根的起源、出根后的形态，并提取番茄嫁接区域不定根的基因组dna，若再生的不定根的根系分级明显且检测到枸杞的dna片段则说明获得转化根。

7、进一步地，番茄苗、木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗培育的方法为：将培养基内无菌枸杞苗移至基质内进行培养10-20天，前3d保持100％的湿度，后与播种后的番茄同于温度22℃～26℃，光照强度100～120μmol·m-2·s-1，光照时间14h/d，相对湿度85％环境培养。

8、进一步地，枸杞木质素含量的测定方法为：选取在基质内培养一定天数长势一致的枸杞，截取从底端向上7.5cm-8.5cm的位置，总共1cm的茎段，并除去叶片，将茎段放入15ml离心管，并开盖于85℃过夜烘干，至恒重后研磨成粉末，于40目过滤网过筛，采用乙酰溴法测定枸杞茎段中木质素含量，用分光光度计在波长280nm测定样品吸光度，通过回归曲线计算木质素含量。

9、进一步地，所述步骤(1)中，砧木的建立方法具体为：将木质素含量低且适于嫁接的枸杞苗从顶端向下5cm位置平切，沿平切后横截面的中心线向下切0.5-1.0cm，得到砧木。

10、进一步地，嫁接的方法具体为：将切好的番茄接穗插入枸杞0.5-1.0cm的劈口中进行嫁接，使番茄接穗与砧木充分接触，从而建立枸杞与番茄高效嫁接体系。

11、进一步地，所述步骤(2)中，利用的外源生长素为2.0mg/l naa。

12、进一步地，所述步骤(3)中，提取番茄嫁接区域不定根基因组dna的方法为：改良ctab法。

13、进一步地，所述步骤(3)中，判断番茄嫁接区域不定根是否检测到枸杞的dna片段的方法为：

14、提取番茄嫁接区域不定根基因组dna，进行基因组重测序；进行生物信息学分析，利用linux cat命令将枸杞基因组与番茄基因组进行连接，将与番茄比对上的reads去除，得到剩余reads与枸杞基因组进行映射，将有读序映射区间的序列提取出来，得到多条相应的dna片段；根据映射到的序列设计引物，进行pcr验证；从而确定番茄嫁接组织部位不定根中含有此段枸杞dna片段；将番茄基因组与映射到的序列混合作为参考基因组，寻找一端比对到番茄基因组一端比对到目标序列的reads；将其中没比对上枸杞的一段截下来形成短片段，blast到参考基因组，并保留blast结果显示只能匹配上番茄的短片段，进行筛选；若筛选得到则说明再生的不定根检测到枸杞的dna片段。

15、进一步地，不定根的基因组重测序的方法为：按照常规基因组二代测序技术进行基因组的重测序，dna建库长度200-300bp，每个reads长度150bp，至少得到24g的数据(番茄基因组总量为800m左右，24g为基因组总量的30倍)。

16、本发明利用的技术涉及rna提取、转录组测序、dna提取、pcr反应、基因组重测序，都是目前分子生物学的成熟技术；同时，bwa、blast等软件的应用可以较为快速方便的得到想要的分析结果。

17、与现有技术相比，本发明至少有以下技术优势：

18、(1)本发明的创新之处首先通过降低木质素的含量，消除远缘细胞之间的隔离层，第一次实现了远缘嫁接属间的，草本与木本植物之间的高效嫁接；

19、(2)本发明通过对番茄接穗进行不同生长素处理，番茄嫁接区域诱导出不定根，通过pcr鉴定，不定根为枸杞基因水平转移的番茄的转化根。

20、(3)本发明的物种枸杞与番茄均为茄科植物，两个物种间存在一些同源序列，后续分析时可能存在一定的困难；本发明的巧妙之处在于将枸杞基因组与番茄基因组利用linux cat命令进行合并，将重测序数据中只要含有番茄的reads就被去除，巧妙的将枸杞与番茄的同源序列去除，剩余数据中只含有枸杞的特异reads及一些比对不上枸杞基因组的reads，将剩余数据与枸杞基因组进行映射，找到与枸杞基因组完全映射到的多条序列；后续定位将多条序列文件与番茄基因组文件合并作为新的参考基因组，并且利用bwa软件寻找一端比对到番茄基因组一端比对到目标reads的重测序序列，并用blast软件进一步筛选，只保留短序列比对上番茄的，此方法具有较强的创新性，对于存在同源序列的物种具有广泛的适用性，属于生物信息学中的个性化分析。

21、综上所述，本发明通过降低枸杞细胞的木质素含量，消除远缘细胞之间隔离层使两个物种嫁接细胞连通，并对番茄接穗进行不同生长素处理，在番茄嫁接组织部位诱导出不定根。通过形态学与分子生物学研究分析，证明了嫁接介导的枸杞与番茄细胞之间发生了水平基因转移，诱导的不定根为枸杞水平基因转移到番茄的转化根。本发明建立了枸杞基因向番茄高效转移的技术体系并获得了转化根，实现了草本植物与木本植物遗传资源的优势互补。