一种茄科作物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用

本发明属于遗传转化，具体涉及一种茄科作物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用。

背景技术：

1、茄子(solanummelongenal.)是茄科茄属一年生草本植物，我国是世界上最大的茄子生产国，茄子具有产量高、适应性强、供应时间长等特点，为夏秋季节主要蔬菜之一。但茄子在栽培过程中经常受到不良环境和病虫害的影响，严重降低茄子的产量及品质。随着分子生物学和生物技术的发展，利用生物技术手段培育具有抵抗不良环境、抗虫抗病的茄子新品种是未来发展的方向。

2、种质资源是种业科技创新的源头，育种技术特别是生物技术的创新和运用是品种改良提质增效的重要手段。当前以基因编辑为代表的生物技术已成为国际育种的前沿和核心，而转基因、基因编辑等技术的运用需要高效、成熟的植物遗传转化体系作为前提。作为转基因技术的关键一步，植物遗传转化体系的建立尤为重要，是探究基因在植物体内功能必不可缺的一步。农杆菌介导法是目前最为成熟、机理最清楚的转基因方法。农杆菌侵染植株后，可将自身载体携带的t-dna片段插入到植物基因组中。利用这一天然特性，可人工改造ti质粒，用外源基因替换载体非必需序列，转化植株后可实现稳定遗传。

3、目前，关于茄子的再生体系多以子叶为外植体，并无报道的完整的遗传转化体系。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种茄科作物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用，且下胚轴为外植体相比与其他部位效率更高。

2、本发明提供了一种茄科作物的培养基组合，包括以下独立包装的试剂：诱导培养基、共培养基、筛选培养基、再分化筛选培养基和生根培养基；

3、所述诱导培养基以ms固体培养基为基础培养基，还包括2.0mg/lzt，ph值为5.8～6.0；

4、所述共培养基以ms固体培养基为基础培养基，还包括2.0mg/lzt，ph值为5.8～6.0；

5、所述筛选培养基以ms固体培养基为基础培养基，还包括2.0mg/lzt、200mg/ltim、75mg/lkan和20g/l活性炭，ph值为5.8～6.0；

6、所述再分化筛选培养基以ms固体培养基为基础培养基，还包括3.0mg/lzt和75mg/lkan，ph值为5.8～6.0；

7、所述生根培养基以1/2ms固体培养基为基础培养基，还包括75mg/lkan，ph值为5.8～6.0。

8、本发明还提供了一种茄科作物的遗传转化体系，包括上述培养基组合和可连接外源基因的载体。

9、本发明还提供了一种基于上述遗传转化体系的茄科作物的遗传转化方法，包括以下步骤：(1)以茄科作物幼苗的下胚轴为外植体，将所述外植体置于诱导培养基上暗培养，得预处理下胚轴；

10、(2)利用包含外源基因的载体的农杆菌侵染所述预处理下胚轴，然后将侵染后的下胚轴在共培养基上进行共培养，得共培养下胚轴；

11、(3)将所述共培养下胚轴转入筛选培养基中进行筛选培养，将长出的愈伤组织转移至再分化筛选培养基进行分化培养，将发出的芽移至生根培养基上，进行生根培养，得遗传转化苗。

12、优选的，步骤(1)所述茄科作物幼苗为无菌茄科作物幼苗。

13、优选的，所述无菌茄科作物幼苗的获取方法，包括：将茄科作物种子置于55～60℃温水中浸泡15min，后放入18～22℃的水中浸泡8～12h，消毒后接种于1/2ms固体培养基上，25℃避光培养，待种子露白后，移至光照条件下培养，得无菌茄科作物幼苗。

14、优选的，步骤(2)所述侵染为利用od600值为0.8的农杆菌制备的侵染液，对所述预处理下胚轴进行侵染。

15、优选的，所述侵染液的制备方法，包括：将含有外源基因载体的农杆菌接种到lb培养基中，菌液转移至含rif和kan的yep液体培养基中进行培养，培养至od600为0.8时，离心收集菌体，用等体积悬浮液重悬，得侵染液。

16、优选的，所述悬浮液为含as的1/2ms液体培养基。

17、优选的，步骤(2)所述共培养、步骤(3)所述筛选培养和分化培养的温度均为25±1℃，光照强度为2500lx，光照时间为16h/d。

18、本发明还提供了上述培养基组合或上述遗传转化体系或上述遗传转化方法在培育转基因茄科作物中的应用。

19、有益效果：本发明提供了一种茄科作物的遗传转化体系，并基于所述遗传转化体系构建了茄科作物的遗传转化方法，通过选取茄子下胚轴作为外植体，使得转化效率使比用子叶作为外植体大大提高，下胚轴作为外植体相比较子叶其抗性芽再生率高58.7％左右，抗性苗成苗率高38.3％左右；通过在培养基中加入活性炭，促进芽的增殖、茎和苗的生长并且有效的防止组培出现的褐化现象；通过利用合适的特美汀tim有效的抑制农杆菌的生长；通过利用合适的预培养时间、农杆菌侵染的时间以及共培养的时间使得转化效率更高。整个愈伤组织诱导过程主要使用ms固体培养基+2.0mg/lzt的培养基，培养基成分更加简单高效；以及通过利用合适浓度的抗性素，没有成功转化基因的幼芽白化死去，含有外源基因载体片段的转基因茄子苗可以分化生长，从而完善以下胚轴做为外植体的茄子遗传转化体系。利用本发明的遗传转化方法，可以更好的研究茄子基因功能，提高茄子的产量、品质和抗性，在为利用基因编辑等生物技术实现茄子种质资源创新和利用及品种定向改良等方面起着至关重要的作用。

技术特征：

1.一种茄科作物的培养基组合，其特征在于，包括以下独立包装的试剂：诱导培养基、共培养基、筛选培养基、再分化筛选培养基和生根培养基；

2.一种茄科作物的遗传转化体系，其特征在于，包括权利要求1所述培养基组合和可连接外源基因的载体。

3.一种基于权利要求2所述遗传转化体系的茄科作物的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)所述茄科作物幼苗为无菌茄科作物幼苗。

5.根据权利要求4所述遗传转化方法，其特征在于，所述无菌茄科作物幼苗的获取方法，包括：将茄科作物种子置于55～60℃温水中浸泡15min，后放入18～22℃的水中浸泡8～12h，消毒后接种于1/2ms固体培养基上，25℃避光培养，待种子露白后，移至光照条件下培养，得无菌茄科作物幼苗。

6.根据权利要求3所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)所述侵染为利用od600值为0.8的农杆菌制备得到的侵染液对所述预处理下胚轴进行侵染。

7.根据权利要求6所述遗传转化方法，其特征在于，所述侵染液的制备方法，包括：将含有外源基因载体的农杆菌接种到lb培养基中，得到的菌液转移至含rif和kan的yep液体培养基中培养至od600为0.8，离心收集菌体，用等体积悬浮液重悬，得侵染液。

8.根据权利要求7所述遗传转化方法，其特征在于，所述悬浮液为含as的1/2ms液体培养基。

9.根据权利要求3所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中共培养和步骤(3)中筛选培养、分化培养和生根培养的温度均为25±1℃，光照强度为2500lx，光照时间为16h/d。

10.权利要求1所述培养基组合或权利要求2所述遗传转化体系或权利要求3～9任一项所述遗传转化方法在培育转基因茄科作物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种茄科作物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用，涉及遗传转化技术领域。本发明提供了一种茄科作物的培养基组合，并基于所述培养基组合构建了茄科作物的遗传转化体系和遗传转化方法，通过选取茄子下胚轴作为外植体，使得转化效率使比用子叶作为外植体大大提高。利用本发明的遗传转化方法，可以更好的研究茄子基因功能，提高茄子的产量、品质和抗性，在为利用基因编辑等生物技术实现茄子种质资源创新和利用及品种定向改良等方面起着至关重要的作用。

技术研发人员：吴雪霞,周亚茹,张爱冬,尚静
受保护的技术使用者：上海市农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12