一种纳米石墨烯生根培养基及其制备方法与应用与流程

本发明属于植物生长，具体涉及一种纳米石墨烯生根培养基及其制备方法与在促进植物生根领域的应用，尤其涉及纳米石墨烯生根培养基在苹果组培苗生根领域的应用以及进行苹果组培快速生出不定根的方法。

背景技术：

1、不定根是植物的非根系组织(如地上茎，地下茎，枝条，叶片等)所发生的根。大多数情况下，不定根的发生是由于植物器官受伤或激素、病原微生物等外界因素的刺激，因此表现为植物的再生反应。不定根的发生扩大了植物的根系，使植物和细胞具有了再生能力，在植物器官扦插和组织培养中广泛使用。此外，它还具有扩大植物吸收面积和增强固着或支持植物的功能，因此，不定根发生的生物学研究是发育生物学的重要领域。它不仅有助于阐明调节植物生长发育的机制，而且会促进许多优良品种的营养繁殖，对农、林与园艺业的发展具有不可估量的价值。在组织培养中，由愈伤组织长出的根，也称不定根。随着现代生物学的发展，通过组织培养进行无性繁殖越来越广泛。植物组织培养的优势在于：

2、1)繁殖速度快，繁殖系数大

3、2)繁殖方式多样化

4、3)繁殖后代整齐一致，保持原有品种优良性状

5、4)可获得无毒组培苗，抢救珍贵植物品种

6、在组培繁殖方面，木本植物不定根发生和生长又比其他植物困难。这一方方是由于木本植物具有生命周期长、遗传杂合几率高、变异性大的原因另一方面是木本植物组培研究起步较晚，许多问题还不清楚。因此建立一种有效缩短植物组培苗生根的组培快繁方法，对于园艺作物等植物组培技术的进一步发展具有重要的意义。

7、纳米石墨烯是尺寸为纳米级的石墨烯的总称，是近年来一直在积极研究的纳米碳物质。具有量子线形状的石墨烯纳米带(也称为石墨烯纳米带)也是纳米石墨烯的成员。由于体系的尺寸位于体积限制中的石墨烯片或芳香族分子的中间，因此预期存在强的尺寸效应和边缘形状效应。

8、目前，许多学者对纳米石墨烯的生物效应已有研究。例如，用一定剂量的石墨烯处理烟草种子发现，在萌发阶段处理可以提高种子水分吸收速度并促进种子萌发，在幼苗生长阶段处理可以促进根和茎的伸长；纳米石墨烯处理番茄植株35天使侧根数目增加了2-3倍，根鲜重增加了0.5倍。关于石墨烯促进植物生长的机制目前主要有两种解释。一方面，石墨烯的含氧功能基团可以聚集水分，而疏水的sp2结构域可以传导水分。石墨烯这种独特的亲水特性和水分传导的性质使其可以促进种子表皮的水分吸收而加速植物萌发并促进植物生长。

9、发明专利申请201810532438.2公布了一种利用石墨烯的植物扦插生根助剂，该发明只含有少量化学制剂，更多的是糖类等营养物质，助剂中的石墨烯及其衍生物具有高吸附、保水、抗菌的功能，给插条提供了一个良好的生根环境，同时助剂不会对土壤和植株造成任何污染和影响，石墨烯只是作为一种辅助纳米材料来保护插条愈伤组织的形成。

10、发明专利申请202010616870.7公布了一种含有石墨烯量子点的大葱分化培养基，根据该发明所描述的，石墨烯量子点可以促进大葱愈伤组织加速分化，是一种花药培养技术。其机理作用主要是通过石墨烯量子点诱导大葱愈伤组织产生不定芽，提高愈伤组织再生效率，属于植物干细胞愈伤组织再分化范畴。

技术实现思路

1、根据以上现有技术的不足，发明人通过研究发现，制备一定剂量的纳米石墨烯，将其配置成纳米石墨烯植物培养基，可以加速苹果组培苗外植体不定根的形成与生长，该项技术对于农、林与园艺产业的发展和植物的无性繁殖技术具有非常重要的应用价值。

2、为实现以上目的，所采用的技术方案是：

3、本发明的目的之一在于提供一种纳米石墨烯生根培养基，包括纳米石墨烯和培养基，所述纳米石墨烯为纳米石墨烯胶体，所述培养基包括蔗糖、大量元素、微量元素、有机化合物、植物激素。

4、进一步，所述纳米石墨烯材料为单层石墨烯，双层石墨烯，多层石墨烯。

5、再进一步，所述纳米石墨烯生根培养基，包括以下组分：

6、(1)大量元素

7、 成分 <![cdata[浓度范围(mg·l^-1)]]> 硝酸钾 800-1100 硝酸铵 800-900 二水氯化钙 200-250 硫酸镁 150-200 磷酸二氢钾 80-90

8、；

9、(2)微量元素

10、

11、；

12、(3)有机化合物

13、 成分 <![cdata[浓度范围(mg·l^-1)]]> 肌醇 80-120 甘氨酸 1.5-2.5 盐酸 0.5-0.6 磷酸吡哆醛 0.4-0.6 盐酸硫胺 0.1-0.2

14、；

15、(4)蔗糖：25000-35000mg·l-1；

16、(5)植物激素：0.1-2.0mg·l-1吲哚乙酸；

17、(6)纳米石墨烯胶体：10-1000mg·l-1。

18、再进一步，上述纳米石墨烯生根培养基还包括琼脂或者植物凝胶，所述琼脂浓度为7000-8000mg·l-1；所述植物凝胶浓度为1000-2000mg·l-1。

19、本发明的目的之二在于提供一种上述纳米石墨烯生根培养基的制备方法，包括以下步骤：通过自行的化学合成或者直接购买获得纳米石墨烯，纳米石墨烯的粒径大小为100nm以下；将1mg-1000mg的纳米石墨烯加入到1l的水中，通过在100w-1000w的功率进行超声10min-60min获得均匀分散的纳米石墨烯胶体溶液；之后将获得的纳米石墨烯胶体溶液添加到培养基中，再将ph调节至5.5-6.0之间，优选ph＝5.8，配置成纳米石墨烯含量为10-1000mg·l-1的纳米石墨烯生根培养基。

20、其中，纳米石墨烯胶体添加到植物组织培养基中的方式可通过以下两种方式：①在培养基灭菌前，将纳米石墨烯胶体按照10-1000mg l-1的浓度添加到培养基中，然后进行ph调节，最后再加入琼脂或植物凝胶成分，并进行灭菌处理。②灭菌前培养基不添加纳米石墨烯，配置好的纳米石墨烯胶体和培养基一起转移至灭菌锅灭菌，灭菌后，纳米石墨烯胶体冷却后，转入密闭式超声波处理系统进行100w-1000w超声处理，时间为10min-60min，超声处理均匀后，加入至培养基中，然后进行ph调节，再加入琼脂或植物凝胶成分，待培养基自然凝固，即可使用。

21、本发明的目的之三在于提供一种上述纳米石墨烯生根培养基在植物生根领域的应用。

22、本发明的目的之四在于提供一种上述纳米石墨烯生根培养基在苹果组培苗生根领域的应用。

23、本发明的目的之五在于提供一种使用上述纳米石墨烯生根培养基进行苹果组培快速生出不定根的方法，该方法的流程如图1所示，所述方法包括以下步骤：

24、1)纳米石墨烯生根培养基制备

25、2)外植体准备

26、组培苗的获取方式为以下三种的任一种：①无性繁殖继代；②苹果种子无菌处理后在培养基中萌发；③采集苹果树幼嫩的茎、枝芽等组织；

27、3)外植体消毒灭菌处理

28、用2％-8％的次氯酸钠溶液进行消毒处理，处理时间10-20min，再用无菌水清洗3-5次即可；

29、4)外植体继代预培养

30、将步骤3)所获得的经消毒灭菌处理的组培苗转移至继代培养基中进行预培养；

31、5)诱导不定根生成

32、将步骤4)获得的预培养苹果组培苗经过适当的剪切后，插入纳米石墨烯生根培养基中，进行不定根生根培养；培养条件为：温度25±5℃，光照强度100-300μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16小时。

33、6)炼苗和移栽

34、培养的外植体生根后从纳米石墨烯生根培养基中取出，根系浸泡在水中，置于自然光下进行练苗，练苗时间为2-4天，将苹果苗移栽至栽培基质中，进行水肥管理即可。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

36、本发明通过在苹果组培苗不定根生长的过程中，添加一定剂量的纳米石墨烯，有效解决了苹果组培苗生根困难，生长速度慢的特点，大大提高了苹果组培苗组培快繁的速度和效率，其创新之处和优势之处在于：

37、1)开发出一种新型的促进苹果组培苗不定根生长发育的纳米材料培养基。经过多次筛选，本培养基大幅降低了植物生长调节剂(植物激素)的应用，即添加少量的吲哚乙酸即可使苹果组培苗生根。

38、2)通过超声波分散的方法，使得纳米石墨烯可以均匀地分散在植物培养基中，使纳米材料的优势更加明显。一方面纳米石墨烯可以穿透苹果外植体韧皮部细胞壁，加快了水分和养分地吸收，同时纳米石墨烯巨大的表面积会吸附吲哚乙酸使其更快速，容易地进入细胞、加速了脱分化诱导细胞分裂形成根原基从而根的发生。经研究发现，外植体不定根的数量和长度的增加可能与纳米石墨烯的浓度有很大关系。

39、3)本发明的优势之处在于为苹果外植体组织培养不定根生长发育建立了一个可靠的培养基。苹果组培苗生根是组织培养过程中最大的难点之一，尤其是一些砧木，以往的传统培养基生根效率低，速度慢，对于珍贵品种和具有重大科研价值的实验材料扩繁速度慢，效果并不理想，而本发明则解决了生根难、生根慢的难题。