一种高复苏率、高兼容性的冻存液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及冷冻保存，特别涉及一种高复苏率、高兼容性的冻存液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞的新陈代谢随着温度下降会变弱，而当环境温度低于-70℃时，细胞几乎停止代谢，呈现出类似“休眠”的状态。根据此现象，在使用血清、培养液、cpa(cryoprotectiveagent，冷冻保护剂)等试剂后，对细胞进行超低温冷冻保存，有利于该品系的保种，而超低温冷冻保存技术也是现阶段最有效的细胞长期保存技术。

2、cpa是一类混合在冻存液中可以降低冻存伤害细胞的化合物，一般分为渗透型和非渗透型两种类型。其中渗透型cpa主要有dmso、乙二醇、丙二醇等，通过其溶剂效应降低细胞内电解质的浓度，降低微小冰晶；非渗透型cpa则主要有聚乙烯吡咯酮(pvp)、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖等，通过增加细胞外渗透压，减少细胞内水分含量，降低了微小冰晶。

3、目前，细胞冻存主要有两种方法，分别为慢速冻存法和玻璃化法；其中慢速冻存法降温缓慢，冷冻保护剂浓度较低，化学毒害较轻，但只能缓慢降温，故形成较多小冰晶导致的机械损伤较大；而玻璃化法由于添加了高浓度冷冻保护剂，可以直接将其置于超低温环境，快速结冻，从而减少形成小冰晶，机械损伤较小，但化学毒害较重。

4、因此，尽管目前超低温冷冻保存技术较为成熟，但主要保存对象是性质较为稳定的细胞系、胚胎组织、微生物等。对于较为脆弱的原代细胞、类器官以及新鲜肿瘤组织，目前成熟的冻存技术仍然较为稀缺。

5、抗冻蛋白(antifreeze proteins，afps)是一类可以帮助生物在低温环境下维持存活的特异性蛋白质，微生物、昆虫、鱼类、植物等多种生物体内均存在天然afps。由于afps有热滞现象、抑制胞体重结冰、修饰冰晶形态及保护细胞膜等抗低温伤害特性，近年来天然提取和生物工程制备的afps已被广泛应用于器官移植、低温医学和生殖医学等领域。

6、tsp是一种半乳糖木葡聚糖，作为一种天然大分子冷冻保护剂，具有无毒，高生物相容性、冰重结晶抑制活性的作用。

7、细胞在冻存、复苏过程极易形成损伤，包括可能发生的胞内、胞外小冰晶形成和升温时重结冰产生的机械损伤，冷冻保护剂的毒性，渗透压休克等情况，导致细胞结构和功能损伤，甚至活力丧失。因此，减少细胞冷冻损伤的相关研究一直备受重视，而其中cpa的选择就尤为重要，目前，细胞冻存多以dmso为主，其毒性较大，对于类器官及组织冻存效果均不佳。

8、同时，传统冻存液中含有动物血清，因其成分较为复杂，来源受限，对于性质不太稳定的原代细胞和类器官的影响较大，且价格昂贵，故不推荐使用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高复苏率、高兼容性的冻存液及其制备方法和应用，以克服现有技术中的不足。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本技术公开了一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，具体包括如下步骤：

4、s1、取动物血清白蛋白，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到动物血清白蛋白母液；

5、s2、取漏芦糖，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到漏芦糖母液；

6、s3、取罗望子多糖，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到罗望子多糖母液；

7、s4、取昆虫抗冻蛋白，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到昆虫抗冻蛋白母液；

8、s5、取穿心莲内酯溶解于二甲基亚砜中，得到穿心莲内酯母液；

9、s6、先取动物血清白蛋白母液、漏芦糖母液、罗望子多糖母液和advance dmem/f12培养液混合得到混合液，根据混合液的体积，按照比例取昆虫抗冻蛋白母液、穿心莲内酯母液混合均匀后，过滤得到高复苏率、高兼容性的冻存液。

10、作为优选，步骤s1中取动物血清白蛋白，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到0.16～0.625g/ml的动物血清白蛋白母液。

11、作为优选，步骤s2中取漏芦糖，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到0.15～0.5g/ml的漏芦糖母液。

12、作为优选，步骤s3中取罗望子多糖，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到0.16～0.625g/ml的罗望子多糖母液。

13、作为优选，步骤s4中取昆虫抗冻蛋白，溶解于advance dmem/f12培养液中，得到1～5mg/ml的昆虫抗冻蛋白母液。

14、作为优选，步骤s5中，取穿心莲内酯溶解于二甲基亚砜中，获得10～50mg/ml穿心莲内酯母液。

15、作为优选，步骤s6中，取5～15份动物血清白蛋白母液、5～15份漏芦糖母液、5～15份罗望子多糖母液和55～85份advance dmem/f12培养液混合得到混合液；再添加混合液体积的1/10000～1/100的昆虫抗冻蛋白母液和1/10000～1/5000的穿心莲内酯母液；混合均匀后，使用滤膜过滤可得所述高复苏率、高兼容性的冻存液。

16、一种高复苏率、高兼容性的冻存液，具体包括以下组分：混合液1份、1/10000～1/100份的昆虫抗冻蛋白母液、1/10000～1/5000份的穿心莲内酯母液；所述混合液由5％～15％动物血清白蛋白母液、5％～15％漏芦糖母液、5％～15％罗望子多糖母液、55％～85％advance dmem/f12培养液组成。

17、一种高复苏率、高兼容性的冻存液的应用，所述冻存液应用于肿瘤组织或原代细胞、类器官；

18、所述冻存液应用于肿瘤组织的方式如下：将肿瘤组织裁剪成若干个组织块，按照比例与所述冻存液混合，在环境温度2～8℃的条件下静置0.5～1小时，再转换至环境温度-70～-80℃的条件下24～36小时，最后转入液氮保存；

19、所述冻存液应用于原代细胞、类器官的方式如下：将原代细胞或类器官直接按照比例与所述冻存液混合，在环境温度-70～-80℃的条件下静置24～36小时；再转入液氮保存。

20、作为优选，所述组织块的大小为1-5mm3；所述组织块与冻存液的比例为100-200个/ml。

21、作为优选，所述原代细胞或类器官与冻存液的比例为1×104～1×106/ml。

22、本发明的有益效果：

23、1、操作简便，冻存范围广，可覆盖原代细胞、类器官乃至肿瘤组织冻存。

24、2、由于所选cpa无毒且高生物相容性，冻存样本复苏活率高。

25、3、使用天然无毒、高生物相容性cpa替代高毒性cpa，可以忽略cpa对样本的毒性。

26、4、使用成分明确的bsa和cfafp代替成分复杂的血清，体系更加稳定。

27、5、使用穿心莲内酯可以抑制凋亡，同时具有广谱抗菌、抗氧化作用，并且对细胞无毒害作用。

28、本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。