一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法

本发明涉及植物细胞培养，更具体地说，它涉及一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法。

背景技术：

1、胚性悬浮细胞系是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养的胚性细胞系。由于其分散性好，生长迅速，细胞形状及细胞团大小均一，重复性好等优点。不仅可直接用于原生质体分离、培养与杂交、基因转移和生产次生代谢物等，还可以在短期内在细胞水平筛选出预期突变体，是一种植物生物技术中便捷高效的技术。目前国内外已有多种植物建立了较为完善的悬浮细胞系，但在菠萝生物育种方面，鲜少见悬浮细胞系相关的研究与应用。

2、现有发明专利cn115644064a提出了一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，该方法筛选生长旺盛、松脆易碎的颗粒状愈伤组织通过液体培养基悬浮培养，经过持续继代同时筛除大颗粒愈伤组织以建立菠萝胚性悬浮细胞系。该菠萝胚性细胞悬浮系中，细胞形状及细胞团大小均一，细胞分散性好，细胞生长增殖迅速，可直接用于原生质体的分离、培养、杂交、基因转移和次生代谢物的生产等，作为遗传转化材料能有效避免嵌合体现象产生，大幅提升菠萝生物育种的成功率和效率。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，能够将悬浮细胞进行植株再生获得菠萝组培苗。

2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，包括以下2个步骤：

3、s1.建立菠萝胚性悬浮细胞系；

4、s2.菠萝植株的再生。

5、本发明进一步设置为：所述s1中初步建立菠萝胚性悬浮细胞系的具体操作如下：以台农17菠萝的冠芽茎段为外植体诱导5至6周，挑选松脆易碎的颗粒状愈伤组织，将愈伤组织用镊子轻轻夹碎放入50毫升三角瓶中，加入20ml菠萝愈伤组织增殖培养基，在28℃恒温摇床上以120rpm的转速进行震荡培养，培养5-7d将悬浮培养物用20目不锈钢网筛筛除大颗粒愈伤组织，将细小颗粒培养物转入胚性细胞诱导培养基培养，每隔2d对菠萝悬浮细胞进行鲜重和干重、细胞数量以及细胞分裂指数的测量，绘制菠萝悬浮细胞生长曲线，确定最适继代周期，根据最适继代周期继代培养，期间使用50目不锈钢网筛筛除大颗粒愈伤组织，并使用显微镜观察菠萝悬浮细胞镜观察悬浮细胞的大小、形态及其他生长状态，直至获得分散稳定的胚性细胞悬浮系。

6、本发明进一步设置为：所述诱导培养基的配方为氯化铵535mg/l、硝酸钾2528mg/l、氯化钙440mg/l、七水硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌1.72mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、谷氨酰胺1000mg/l、干酪素水解物500mg/l、精氨酸120mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.4mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、毒莠定9.9mg/l、脱落酸0.053mg/l、2-吗啉乙磺酸300mg/l、蔗糖30g/l、活性炭2g/l，ph＝5.8。

7、本发明进一步设置为：所述s2中菠萝植株的再生具体操作如下：挑选s1中悬浮培养获得的较大细胞团颗粒，接种到诱导体细胞胚发生的固体培养基上，经过一定时间的继代培养，将有体细胞胚发生的愈伤组织转接到再生培养基上实现菠萝植株的再生。

8、本发明进一步设置为：所述菠萝悬浮细胞的鲜重测定具体操作如下：取充分混匀的菠萝细胞悬液，注入预先称重的离心管中，5000rpm离心10min，吸去上清液，室温下敞口自然风干24h后称重，减去空管重量即为菠萝悬浮细胞的鲜重。

9、本发明进一步设置为：所述菠萝悬浮细胞的干重测定具体操作如下：取称完鲜重的菠萝悬浮细胞，70℃烘干24h后称重，减去空管重量即为菠萝悬浮细胞的干重。

10、本发明进一步设置为：所述菠萝悬浮细胞数量的测定具体操作如下：取充分混匀的菠萝细胞悬液，加入所取量2倍体积的8‰的三氧化铬，置70℃水浴处理15min，冷却后，用移液管反复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴悬液置入血细胞计数板上计数。

11、本发明进一步设置为：所述菠萝悬浮细胞分裂指数的测定具体操作如下：取混合均匀的菠萝细胞悬液，加入所取量2倍体积的8‰的三氧化铬，置70℃水浴处理15min，冷却后，用移液管反复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴悬液置于载玻片上，滴一滴醋酸洋红染液，盖上盖玻片，在酒精灯上微热则细胞核被染上色而胞质无色，于显微镜下观察记录分裂期和分裂间期细胞个数，计算细胞分裂指数。

12、综上所述，本发明具有以下有益效果：

13、以叶片、茎段或愈伤组织为转化对象进行生物育种，转化后代容易存在大量的嵌合体现象，常在转基因后代的培养过程中目标性状逐渐丢失，最后导致育种失败。以单个菠萝胚性细胞为转化对象能有效避免嵌合体现象的产生，大幅提升菠萝生物育种的成功率。并且胚性悬浮细胞系可以重复利用节省生物育种中的人力与财力，且胚性悬浮细胞作为受体更容易浸染，可有效提高遗传转化的效率。

14、目前菠萝基因工程育种多以叶片、茎段或愈伤组织为转化对象，通过建立菠萝胚性悬浮细胞系，可有效提高菠萝生物育种效率，为菠萝高产优质多抗新品种的选育奠定基础。

技术特征：

1.一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：包括以下2个步骤：

2.根据权利要求1所述的一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：

3.根据权利要求2所述的一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：

4.根据权利要求1所述的一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：

5.根据权利要求2所述的一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：

6.根据权利要求5所述的一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：

7.根据权利要求2所述的一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：

8.根据权利要求2所述的一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，其特征是：

技术总结
本发明公开了一种菠萝悬浮细胞再生成苗的方法，涉及植物细胞培养技术领域，其技术方案要点是：筛选可以快速生长的愈伤组织通过液体培养基悬浮培养，经过持续继代同时筛除大颗粒愈伤组织以建立菠萝胚性悬浮细胞系。对培养基质、蔗糖含量、pH、培养温度和转速、接种量、筛网大小、继代周期等因素进行调节不断优化培养条件，成功构建一套可快速产生分散性好，生长迅速，细胞形状及细胞团大小均一的菠萝胚性细胞的菠萝胚性悬浮细胞系，并成功进行菠萝植株再生。

技术研发人员：王悠,常胜合,舒海燕
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院海口实验站
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15