一种细胞冻存液及其制备方法与流程

本发明涉及细胞冻存，尤其涉及一种细胞冻存液及其制备方法。

背景技术：

1、细胞冻存液是一种用于将活细胞长期保存的液体制剂。在细胞冻存过程中，细胞需要被迅速冷冻并保存在极低的温度下，以防止细胞的死亡和损伤。

2、但是现有技术中仍然存在一些缺陷，如细胞在冻存过程中容易受到温度变化、冷冻过程中形成的冰晶、化学品和机械刺激等因素的影响，导致细胞死亡率较高。细胞冻存液的组成和配方因不同类型的细胞和实验室而异，缺乏一致性和标准化。可能会出现细胞污染问题，在细胞冻存液的制备和使用过程中，可能会出现细胞污染问题，如细菌、真菌、病毒等的污染，这会影响实验结果的准确性和可靠性。不同类型的细胞对细胞冻存液的成分和配方有不同的适应性，需要针对不同的细胞类型进行调整和优化。存储条件要求高，细胞冻存液需要在极低的温度下保存，如液氮或超低温冰箱，这对实验室的设备和管理要求较高。

3、为解决以上问题，静电纺丝技术已广泛应用于生物医学领域的高分子支架材料的制造，如药物输送、组织等工程、诊断、生物传感器和酶固定化。特别是静电纺丝具有独特的生产纳米至微米直径连续纤维的能力，使其成为构建茧状纤维支架的一种很有前途的技术。在解冻过程中快速的升温速率和均匀的热分布可以抑制冰的形成和生长，从而提高低温保存的效果。然而，大多数天然或合成聚合物都是不良的导热体。为了克服这一障碍，各种导电填料，如氧化铝、氮化硼、碳化硅、碳纳米管已被加入到聚合物中以增加支撑材料的导热性，但总是存在生物相容性问题，难以提高细胞冻存的活性和活力。

4、发明授权专利cn112293409b公开了一种细胞冻存液，所述细胞冻存液中包括钠离子、钾离子、镁离子、氯离子、醋酸根离子、葡萄糖酸根离子和甘露醇，所述细胞冻存液的溶剂为水。该发明所提供的细胞冻存液和中性粒细胞的体外储存方法，不仅步骤简单、成本低廉，还可以长时间地保持中性粒细胞的活性。相对于使用普通培养基的保存方法，该发明所提供的细胞冻存液能够更好地保持中性粒细胞的活性，冻存、复苏后的中性粒细胞依然具有良好的吞噬及杀菌作用，改善了中性粒细胞的临床应用，从而具有良好的产业化前景。但是，该发明制备的细胞冻存液中各种离子的添加需要精确控制，否则可能会导致细胞死亡率升高或代谢功能降低等不利影响；甘露醇也可能会对细胞膜的通透性产生影响，导致细胞的代谢和生长受到影响。

5、发明授权专利cn107027743b公开了一种细胞冻存液，包括基础培养基、血小板裂解物、bfgf和l-谷氨酰胺，该细胞冻存液不含动物血清和不含dmso，消除动物血清可能引入外源性病毒的可能性和消除dmso对脂肪干细胞的不良影响；而且，该发明还提供了细胞冻存方法，该方法无需复杂的程序性降温，操作简单。采用该发明公开的细胞培养基和该发明公开的冻存法冻存脂肪干细胞一年后，细胞存活率能达到93％，且不影响脂肪干细胞分化能力。但是，该发明提供的细胞冻存液中血小板裂解物和bfgf的质量和浓度需要严格控制，否则可能会对细胞的生长和代谢产生影响。该细胞冻存液和冻存方法可能不适用于所有类型的细胞，冻存效果不稳定。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术中细胞冻存液冻存复苏效果差的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种冻存复苏效果好的细胞冻存液及其制备方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、一种细胞冻存液，包含如下成分：甘油、血小板裂解物、脯氨酸、l-谷氨酰胺和支架材料、基础培养基补足。

4、所述甘油在细胞冻存液中占比为5～10v/v％。

5、所述基础培养基为rpmi-1640、mem、高糖dmem、低糖dmem或dmem/f12中的一种。

6、所述血小板裂解物在细胞冻存液中占比为3～8v/v％。

7、所述脯氨酸在细胞冻存液中占比为0.5～2w/v％。

8、所述l-谷氨酰胺在细胞冻存液中占比为0.4～0.6w/v％。

9、所述支架材料在细胞冻存液中占比为0.5～2w/v％。

10、一种细胞冻存液的制备方法如下：

11、按照体积或重量体积比称取各成分，然后将各成分5～20rpm搅拌混合3～10min，即得细胞冻存液。

12、所述支架材料的制备方法如下，以重量份计：

13、s1、将1～3份海藻酸钠加入到180～220份30～50℃的水中，使用0.2～0.5mol/l盐酸将ph调节到3～4，然后加入1～5份1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.5～2份n-羟基琥珀酰亚胺，在30～50℃、100～300rpm搅拌3～8h，反应混合物用透析管进行透析，透析管截取分子量为4000～6000da，然后冷冻干燥，得到复合材料；

14、s2、将0.5～2份聚氧化乙烯加入到80～120份6～9wt％的蚕丝蛋白水溶液中，100～300rpm搅拌1～5h，得到混合溶液；然后，将10～20份聚酰胺酰亚胺加入上述混合溶液中，40～50℃、300～800rpm搅拌8～15h，得到纺丝液a；

15、s3、将3～8份明胶加入到80～120份10～20wt％聚乳酸溶液中以100～300rpm搅拌10～50min，然后加入3～8份氧化石墨烯以300～800rpm搅拌8～15h，得到纺丝液b；将步骤s2制备的纺丝液a、纺丝液b分别转移到不同注射器中同时进行静电纺丝，将复合材料加水配置成0.5～2wt％的水溶液，用于纺丝液a和纺丝液b静电纺纤维的收集，收集完毕后，静置反应10～30h，用水洗涤，冷冻干燥，得到支架材料。

16、所述聚乳酸溶液为聚乳酸与六氧异丙醇混合配置而成。

17、所述静电纺丝正电压都为18～22kv，流速都固定在0.4～0.6ml/h。

18、所述细胞的冻存复苏步骤如下：

19、将脂肪细胞加入到所述细胞冻存液中，1～5℃保存10～40min，-10～-30℃保存1～3h后转移到-70～-90℃冰箱中长期保存；所述脂肪细胞的复苏步骤为将冻存的脂肪细胞从-70～-90℃冰箱中取出，快速转移到35～38℃水浴锅中轻柔晃动解冻。

20、甘油是一种常用的冻存保护剂，可以通过降低细胞内水分减少细胞冻结时的损伤。血小板裂解物是由血小板中释放的生长因子和细胞外基质组成的混合物，可以提供细胞生长所需的生长因子和细胞黏附蛋白，有助于维持细胞的稳定性和存活率。

21、脯氨酸和l-谷氨酰胺是氨基酸，在细胞代谢过程中起着重要的作用。脯氨酸可以增加细胞在冻存过程中的抵抗力和生存能力，而l-谷氨酰胺则可以提供细胞所需的能量和代谢底物，有助于维持细胞的生长和代谢。

22、支架材料是指一种用于支撑和定向生长细胞的材料，可用于组织工程和生物医学应用中。本方法中的支架材料是一种复合材料，由海藻酸钠、蚕丝蛋白、聚乳酸、氧化石墨烯等多种材料组成，可以提供细胞附着的支撑和定向生长的结构，有助于细胞的定向生长和组织工程的构建。

23、基础培养基是细胞培养中常用的一种培养基，含有细胞所需的营养物质和生长因子，可以提供细胞所需的营养和生长因子，有助于细胞的生长和繁殖。本方法中选择了常用的基础培养基rpmi-1640、mem、高糖dmem、低糖dmem或dmem/f12中的一种，以适应不同类型的细胞。

24、本方法中的制备步骤主要涉及到物理化学方法和生物技术方法，包括称取、搅拌混合、透析、静电纺丝等。其中，静电纺丝是一种新兴的生物技术方法，可以制备出具有纳米级尺寸的纤维支架材料，具有高比表面积和大孔隙度，适用于细胞定向生长和组织工程的构建。

25、总的来说，本方法制备的细胞冻存液具有营养成分比例合理、添加支架材料、制备简便、适用范围广、可调整性强等优点，可以满足细胞冻存和组织工程等生物医学领域的需求，并且在细胞冻存液和支架材料的制备方面具有一定的创新性和先进性。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果：

27、1)本发明制备的细胞冻存液组成丰富，包含多种成分，如甘油、血小板裂解物、脯氨酸、l-谷氨酰胺等，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子，有助于维持细胞的稳定性和存活率。

28、2)本发明制备的细胞冻存液中的成分可以减缓细胞的生长速度，有助于降低细胞在冷冻和解冻过程中的损伤，提高细胞的存活率和活力。

29、3)本发明制备的细胞冻存液能增强细胞抗冻能力，减少细胞在冷冻和解冻过程中的损伤。

30、4)本发明以蚕茧的纤维结构和保护功能为灵感，以改善细胞的低温保存效果；采用静电纺丝、原位表面功能化和冷冻干燥相结合的方法，开发了一种蚕丝蛋白、聚乳酸和氧化石墨烯复合支架材料，具有三维蓬松结构，可以促进细胞的附着和增殖，导热性强，从而在冻融过程中提供快速均匀的温度传递。