一种RUNX2基因不表达的异种移植供体猪及制备方法

本申请属于动物基因工程领域，具体涉及一种runx2基因不表达的异种移植供体猪及制备方法。

背景技术：

1、来自不同物种供体的器官、组织和细胞的异种移植可以有效解决人供体的短缺。异种移植相对于自体移植、同种移植更有利之处包括在可预测的非紧急基础上供应、在控制环境中产生和可在移植前用于表征和研究。在诸多文献中得到证实在异种移植供体动物模型中，猪已成为异种移植领域中大多数研究的焦点，因为猪与人共享许多解剖和生理特征。猪也具有相对短的妊娠期，可以在无病原体环境中育种，并且可能不呈现与通常不用作食物来源的动物有关的相同伦理问题。

2、但目前的研究结果中，在将猪的器官移植到人体时会出现比自体移植、同种移植更加严重的多的免疫排斥反应，因为存在很多未知的引起免疫排斥的风险因子，影响猪的组织或器官植入后的长期存活，包括引起排斥反应的异源基因。

3、目前关于runx2基因研究如下：runx2(全称runx family transcription factor2)转录因子，是高度保守的runx转录因子家族的成员。runx2主要在人类nk细胞分化过程中表达。runx2基因敲除抑制nk细胞发育，而过表达则加速成熟nk细胞的产生。runx2可能通过调节il-2rβ表达调控人类nk细胞分化。runx2抑制细胞毒效应分子和细胞因子的表达，直接调控肿瘤坏死因子-α及其效应分子。runx2敲除导致小鼠nk细胞数量显著减少。runx2在体内也是人类nk细胞发育所必需的。runx2与ets1和t-box因子合作，控制nk细胞的发育或功能过程。runx2在调节正常发育和肿瘤发生中起关键作用。runx2通过调节肿瘤代谢和白血病细胞迁移在人类t-all(t细胞急性淋巴性白血病)高危亚型中起着依赖性因子的作用，是t-all存活所必需的，其异常表达可增强疾病的播散。在功能上，runx2诱导cxcr4介导的t-all细胞迁移。在更具侵袭性的癌细胞中，runx2能促进细胞分泌蛋白质的基因转录，这些蛋白质有助于重塑肿瘤周围的环境，使癌细胞更容易逃脱。runx2介导的变化发生在癌症进展和转移的晚期，主要的致癌作用已被描述为runx2在肿瘤发展中的作用。

技术实现思路

1、本发明研究发现runx2基因能引起异种免疫排斥风险，runx2基因不表达的可有效降低供体组织和/或器官细胞与接受者igg和igm的结合能力，提高供体组织和/或器官细胞抵抗接受者补体介导的细胞毒性的能力，可以延长供体组织和/或器在异种移植后的生存时间。根据上述本发明提供一种异种移植供体猪，所述的供体猪的器官、组织或细胞中runx2基因不表达，所述的接受者为人。

2、本发明所述的runx2基因不表达可以通过基因敲除、基因敲入、点突变；缺失突变以及它们的组合实现。

3、本发明所述的runx2基因不表达可以通过基因沉默实现。

4、本发明所述的基因敲除通过crispr-cas9基因敲除系统实现，所述的系统包括runx2基因敲除载体，包括载体一和载体二，所述的载体一连接有sgrn a1，所述的sgrna1特异性靶向序列为agcactccatacctctacta；所述的载体二连接有sgrna2，所述的sgrna2特异性靶向序列为cagcgtcaac gccatcattc。

5、本发明所述的runx2基因敲除载体的构建方法：

6、合成所述的sgrna1的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其互补链如seqid no.2所示，再将单链的sgrna的dna序列分别经过退火后形成sgrna1寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连入px330质粒载体中；

7、合成所述的sgrna2的编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，其互补链如seqid no.4所示，再将单链的sgrna的dna序列分别经过退火后形成sgrna2寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连入px330质粒载体中。

8、本发明所述的runx2基因敲除载体导入转化细胞，所述的转化细胞用于制备异种移植用供体猪，所述的供体猪的器官、组织或细胞中runx2基因不表达。

9、本发明还提供一种异种移植供体制备方法，包括将所述的转化细胞移植到脱核的卵细胞来形成核移植卵，再将所述的核移植卵移植到代孕母的输卵管。

10、本发明还提供一种延迟、减少或防止人接受者中对异种移植器官或组织排斥、分离或不良反应的方法，所述的方法包括所述的方法包括对供体猪的组织或是器官的runx2基因进行遗传修饰，使供体猪或供体猪的组织、器官的runx2基因不表达。

11、本发明所述的异种移植供体的器官包括肝、肺、肾或皮肤。

12、本发明所述的异种移植供体的组织包括神经。

13、有益效果如下：

14、本发明首次发现runx2基因能引起异种免疫排斥风险，根据此提供一种异种移植供体，通过基因敲除或是基因沉默实现异种移植供体的runx2基因不表达，runx2基因不表达的可有效降低供体组织和/或器官细胞与人接受者igg和igm的结合能力，提高供体组织和/或器官细胞抵抗人接受者补体介导的细胞毒性的能力，可以延长供体组织和/或器在异种移植后的生存时间。

15、本发明利用crispr/cas9系统设计双sgrna敲除runx2基因，获得的基因敲除细胞系可作为体细胞核移植的供体，runx2敲除后可有效降低猪肾细胞与人igg和igm的结合能力，提高猪肾细胞抵抗人补体介导的细胞毒性的能力，并为深度挖掘runx2基因生物学功能提供有利的研究工具。

16、本发明所确定的风险因子runx2基因的敲除增加了异种细胞存活的机率，进一步提高了异种移植的可行性。

技术特征：

1.一种异种移植供体猪，其特征在于，所述的供体猪的runx2基因不表达。

2.如权利要求1所述的异种移植供体猪，其特征在于，所述的异种移植供体猪的器官、组织或细胞的接受者为人。

3.如权利要求1所述的异种移植供体猪，其特征在于，所述的runx2基因不表达通过基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变以及它们的组合实现，或通过基因沉默实现。

4.一种runx2基因敲除载体，其特征在于，所述的runx2基因敲除载体包括载体一和载体二：所述的载体一连接有sgrna1，其特异性靶向序列为agcactccatacctctacta；所述的载体二连接有sgrna2，其特异性靶向序列为cagcgtcaacgccatcattc。

5.一种转化细胞，其特征在于，所述的转化细胞导入有如权利要求4所述的runx2基因敲除载体，所述的转化细胞用于制备异种移植用供体猪，所述的供体猪的runx2基因不表达。

6.一种异种移植用转基因供体猪的制备方法，包括：将如权利要求5所述的转化细胞移植到脱核的卵细胞来形成核移植卵，将所述的核移植卵移植到代孕母的输卵管。

7.一种延迟、减少或防止人接受者中对异种移植组织排斥、分离或不良反应的方法，其特征在于，所述的方法包括对供体猪的组织或是器官runx2基因进行遗传修饰，使供体猪的组织或是器官runx2基因不表达。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的器官包括肝、肺、肾或皮肤。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的组织包括神经。

技术总结
本发明提供一种RUNX2基因不表达的异种移植供体猪及其制备方法，RUNX2基因能引起异种免疫排斥风险，还利用CRISPR/Cas9系统敲除RUNX2基因，验证了RUNX2基因不表达可有效降低供体猪的器官、组织和/或细胞与接受者IgG和IgM的结合能力，提高供体猪的器官、组织和/或细胞抵抗接受者补体介导的细胞毒性的能力，可以延长供体猪的器官、组织和/或猪细胞接受者生存时间。

技术研发人员：欧阳红生,袁泓明,逄大欣,王子茹
受保护的技术使用者：吉林大学重庆研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16