高产毛木耳食用菌菌棒制备方法与流程

本发明涉及一种高产毛木耳食用菌菌棒制备方法，属于农业微生物应用。

背景技术：

1、毛木耳学名（auricularia polytricha）又称黄背木耳，其营养成分与黑木耳相似，具有清肺益气、止痛活血的功效。毛木耳粗纤维含量较高，这些纤维素对人体内许多营养物质的消化、吸收和代谢有很好的促进作用。

2、近年来，由于菌种不同程度的退化、病虫害、环境污染使得毛木耳的产量和品质都受到了一定程度的影响，而国内外市场对木耳属商品质量品质要求越来越严格。南方气候温热潮湿，加上秋冬过后气温回升快、温度变化大，又多阴雨，容易招致病虫害，常引起烂棒、“流耳”等症状，栽培毛木耳易发生病虫害，影响整个毛木耳产业的产量和品质。“春耳”管理主要在2—4月，这一时期的显著特点是耳棒基质中营养贮备下降、耳棒变软，菌丝抗性下降，空气湿度高，加强通分透气也难以降低菌丝所处环境湿度，且通风过于频繁易引入杂菌，导致培养过程中杂菌滋生，发生烂棒现象。因此，亟需提供一种抗杂菌性强、含水率稳定的菌棒制备方法，提高毛木耳的产量。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：提供一种抗杂菌性强、含水率稳定、耐高温的高产毛木耳食用菌菌棒制备方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

3、（1）母种制备：

4、母种培养基配方：以重量计，去皮马铃薯50～150份，葡萄糖10～15份，琼脂5～20份，抗杂菌添加剂2～4份，磷酸二氢钾2～4份，硫酸镁1～3份，水800～1200份，ph自然。

5、将去皮马铃薯加水煮沸20min至熟而不烂，4层纱布过滤取汁，滤液稀释，然后加所述重量份的葡萄糖、抗杂菌添加剂、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂，待琼脂完全融化后，分装15×150毫米的试管，在0.098～0.12兆帕压力下灭菌20～30分钟，制试管斜面，冷却至室温后在无菌条件下接种0.3cm2的毛木耳原始母种，放置在22～32℃培养室中培养12～16天。

6、（2）原种制备：

7、原种培养基配方：以重量计，棉籽壳50～100份，麸皮5～20份，抗杂菌添加剂3～5份，水85～430份

8、棉籽壳暴晒2～3天，粉碎至颗粒状，直径小于6毫米，其中颗粒状直径在4-6毫米要占总数量的50％；将粉碎的棉籽壳、麸皮、抗杂菌添加剂混合到一起，搅拌均匀让水浸透，将培养料装入750ml菌种瓶，在0.12～0.15兆帕下灭菌1.5～2小时，待菌种瓶冷却后在无菌条件下接入1～2cm2的母种，放置在22～32℃培养室中培养18～24天；

9、（3）栽培种培养基的配制：

10、栽培种培养基配方：以重量计，玉米秸秆140～260份，改性碱液7～13份，抗杂菌添加剂5～8份，麸皮10～30份，改性纤维4～6份，水100～300份；

11、选择新鲜、无霉变的玉米秸秆，暴晒2～3天，将玉米秸秆切成0.5～0.6cm长，切碎的玉米秸秆用改性碱液浸泡240～300min，浸泡6h后沥干，拌入其他辅料混合，堆焖2小时，备用；

12、（4）装袋：选用宽、长和厚为14cm～17cm×28cm～35cm×0.04cm～0.05cm聚丙稀折角塑料袋，将已处理好的栽培培养料装入塑料袋中，栽培培养料重0.75～1.2千克，装完后用一直径1.5厘米的木棒在料中央位置从上向下打一洞，用塑料绳扎口；

13、（5）灭菌；可采用常压灭菌或高压灭菌，常压灭菌1个大气压保持8～12个小时，高压灭菌在0.12～0.15兆帕下保持2～3小时；

14、（6）接种：先使用消毒酒精擦拭手和接种镊子，在菌棒的接种端取出打孔棒，使用镊子将成块的固体菌种接入孔穴，接满整个孔穴，最后使用灭菌的海绵封口；

15、（7）发菌培养：接种后的栽培袋移入培养室培养发菌，发菌期温度控制室温保持在22～38℃，自然湿度即可，在避光的环境中培养，菌丝长满便可得到待栽培的毛木耳菌棒。

16、所述抗杂菌添加剂的制备方法为：

17、（1）称取50～80份茶树菇干制品置于60℃烘箱干燥20min后，经高速万能粉碎机粉碎并过80～100目筛，然后用超微粉碎机进行超微粉碎10min，得到茶树菇超微粉，称取茶树菇超微粉按液料比30～50:1加入水，浸泡20～30min后，得到混合物1；

18、（2）将30～70份铁刀木枝干烘干，粉碎成30～50目，溶解于乙醇中，加入混合物1，在温度为37℃，200r/min的水平振动台下振荡5h，分离滤液与滤渣，滤液抽滤回收，滤渣重复上述步骤提取共3次，将3次所得乙醇提取物置于50～60℃旋转蒸发仪旋蒸后溶解于水，-80℃下冷冻干燥，得到水提取物1；

19、（3）采集90～120份苍耳嫩叶，洗净，室内阴干，粉碎后过0.2～0.3mm筛，装入浸提缸内，按液料比12～18:1加入95%乙醇，充分搅拌后将提取缸置于超声波提取仪中，温度控制在20～40℃超声波辅助提取1h，取出后室温条件下浸提3d，抽滤，滤渣再次装入提取缸中，重复上述操作2次，合并滤液，经旋转蒸发仪减压浓缩后得到苍耳叶乙醇粗提物；

20、（4）将苍耳叶乙醇粗提物加入5～10份石油醚萃取，石油醚萃取后的水相加入水提取物1，继续用10～30份乙酸乙酯萃取，最终制备得到乙酸乙酯萃取组分，经旋转蒸发仪减压浓缩后，得到所述抗杂菌添加剂。

21、所述改性碱液的制备方法为：

22、（1）将40～80份的β-环糊精置于高温管式炉中，以10℃/min的升温速率到达400～600℃；活化后的β-环糊精经蒸馏水超声清洗，15000～20000rpm离心30～60min，用干燥箱真空干燥24h，得到活化β-环糊精；

23、（2）将80～150份新鲜酒糟用蒸馏水清洗至洗液澄清，烘干后以料液比为1∶20～30（g/ml）比例加入碱性提取剂，在200～300w功率条件下进行超声波处理，室温处理7～15min，然后在布氏漏斗上用尼龙布过滤，滤液用乙酸中和至ph7.5～8.5，在4500r/min的转速下离心20min，上清液加入3～5倍体积的乙酸乙酯，室温沉降12h后过滤，将沉淀冷冻干燥，得到酒糟沉淀，所述碱性提取剂各组分以及各组分重量百分比为：氢氧化钙8～15%，过氧化氢6～12%，乙醇20～38%，正丁醇14～35%；

24、（3）活化β-环糊精与酒糟沉淀中加入60～120份ph为7.5～8.5的碱性离子水，进行真空渗透，渗透温度为20～50℃，真空度为0.2～0.5mpa，抽气速度为70～90升/秒，得到所述改性碱液。

25、所述改性纤维的制备方法为：

26、（1）采用高速万能粉碎机将200～260份葵花壳籽粉碎，粉碎后过1～3mm筛，加10%的h2o2溶液300～360份，室温下静置6h，在5000r/min的转速下离心5min，沉淀在60℃电热真空干燥箱内干燥24h，得到混合物1；

27、（2）将高岭石粉碎，取140～160份粒径为10～20目的粉末，加入混合物1，添加300～350份30%h2o2溶液，混合均匀，管中产生大量气泡，待气泡消失，得以完全去除含有的有机质，除去有机质后，离心分层，并去除上层清液，继续烘干，得到混合物所述改性纤维。

28、本发明的有益效果在于：

29、（1）茶树菇提取物中含有大量的游离氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸等17种。同时含有充当多种酶辅助因子的各类矿物质，锌、铁、铜、锰、镁、钙等，含有的营养物质丰富。本发明通过铁刀木中甾体及生物碱对茶树菇提取物中化合物进行改性，促进了菌丝对氮素及微量元素的吸收同化，同时提高了茶树菇提取物中的微量元素生物学有效性，使得培养的菌种菌丝发育粗壮，长势旺盛。

30、（2）苍耳叶中含有的倍半萜内酯类化合物对毛木耳病原菌的抑菌性强，同时能够有效抑制病原菌孢子萌发，能有效避免培养过程中产生杂菌，提高菌种的纯度，苍耳叶水相萃取物与铁刀木含有的蒽醌类化合物复配，经乙酸乙酯处理后抗菌活性显著增强。

31、（3）铁刀木含有的蒽醌类化合物对细菌被膜的形成具有干预作用，且不会产生细菌耐药性，能清除细菌感染时的有害代谢物和死后菌体留下的内毒素，可以干扰部分真菌细胞壁物质合成，使真菌芽管以及菌丝体膨大、破裂，导致真菌细胞内容物泻出而死亡。

32、（4）环糊精通过内部的截锥空腔包络客体分子从而起到吸附作用。本发明通过活化β-环糊精与多种物质混合，共混改性，能有效吸附有毒有害的有机物、重金属离子和放射性元素等，环糊精具有co2吸附性能，控制体系二氧化碳浓度维持在菌种生长最佳条件范围内。

33、（5）高温条件，酒糟加快分解，产生的还原糖进一步补充培养基营养成分，分解过程中吸收体系的热量，降低了相对封闭环境下菌种所处环境的温度，提高了菌种的耐高温性，本发明通过采用碱性提取剂提取热分解物质，碱性离子水真空渗透，控制提取物热分解温度范围，改变了热分解活化能，使酒糟中各组分在高温天气分解吸收热量，维持体系温度适合菌丝生长。

34、（6）采用的碱性离子水不仅能满足无菌要求，并且能中和掉菌丝生长过程中产生的酸性代谢物质，防止体系酸化，维持体系ph稳定。

35、（7）高岭石中含有的矿物能够与水相互作用，随着环境的湿度变化，与水结合成强度依次减弱的结晶水、层间吸附水及自由水，能够相对稳定地控制环境湿度在一定范围内。

36、（8）葵花籽壳中水分吸附特性与其化学组分含量及细胞壁孔隙尺寸密切相关，外界湿度变化时，葵花籽壳中含有的α-纤维素和半纤维素平衡含水量发生变化，半纤维素在相对湿度75%左右发生软化，使得木材细胞壁容纳水分子的能力增强。此外，半纤维素和其它提取物均具有疏水性，其含量与平衡含水率均呈负相关，对水的饱和吸附量也会有所不同，本发明通过工艺改进使得葵花籽中α-纤维素和半纤维素与高岭石中矿物相结合，最终提取物具有的水分吸附能力，能满足毛木耳菌丝生长阶段对空气湿度的要求，稳定环境的湿度，从而实现对环境湿度的自动调节。相对于传统制备方法中，通过加强通风控制体系的湿度，从而避免气候潮湿时烂棒率升高。本发明技术方案能够稳定控制环境的湿度，避免了通风过程中内外空气交换过于频繁易引入杂菌，导致培养过程中杂菌滋生，发生烂棒现象，进一步提高了菌棒的抗杂菌能力。

37、实施例

38、抗杂菌添加剂的制备:

39、（1）称取65kg茶树菇干制品置于60℃烘箱干燥20min后，经高速万能粉碎机粉碎并过90目筛，然后用超微粉碎机进行超微粉碎10min，得到茶树菇超微粉，称取茶树菇超微粉按液料比40:1加入水，浸泡25min后，得到混合物1；

40、（2）将50kg铁刀木枝干烘干，粉碎成40目，溶解于乙醇中，加入混合物1，在温度为37℃，200r/min的水平振动台下振荡5h，分离滤液与滤渣，滤液抽滤回收，滤渣重复上述步骤提取共3次，将3次所得乙醇提取物置于55℃旋转蒸发仪旋蒸后溶解于水，-80℃下冷冻干燥，得到水提取物1；

41、（3）采集105kg苍耳嫩叶，洗净，室内阴干，粉碎后过0.25mm筛，装入浸提缸内，按液料比15:1加入95%乙醇，充分搅拌后将提取缸置于超声波提取仪中，温度控制在30℃超声波辅助提取1h，取出后室温条件下浸提3d，抽滤，滤渣再次装入提取缸中，重复上述操作2次，合并滤液，经旋转蒸发仪减压浓缩后得到苍耳叶乙醇粗提物；

42、（4）将苍耳叶乙醇粗提物加入7份石油醚萃取，石油醚萃取后的水相加入水提取物1，继续用20份乙酸乙酯萃取，最终制备得到乙酸乙酯萃取组分，经旋转蒸发仪减压浓缩后，得到所述抗杂菌添加剂。

43、改性碱液的制备：

44、（1）将60kg的β-环糊精置于高温管式炉中，以10℃/min的升温速率到达500℃；活化后的β-环糊精经蒸馏水超声清洗，17500rpm离心45min，用干燥箱真空干燥24h，得到活化β-环糊精；

45、（2）将115kg新鲜酒糟用蒸馏水清洗至洗液澄清，烘干后以料液比为1∶25（kg/l）比例加入氢氧化钙、过氧化氢、乙醇、正丁醇重量百分比为11:9:29:25的碱性提取剂，在250w功率条件下进行超声波处理，室温处理11min，然后在布氏漏斗上用尼龙布过滤，滤液用乙酸中和至ph8.0，在4500r/min的转速下离心20min，上清液加入4倍体积的乙酸乙酯，室温沉降12h后过滤，将沉淀冷冻干燥，得到酒糟沉淀；

46、（3）活化β-环糊精与酒糟沉淀中加入90kgph为8.0的碱性离子水，进行真空渗透，渗透温度为35℃，真空度为0.35mpa，抽气速度为80升/秒，得到所述改性碱液。

47、改性纤维的制备：

48、（1）采用高速万能粉碎机将230kg葵花籽壳粉碎，粉碎后过2mm筛，加10%的h2o2溶液330kg，室温下静置6h，在5000r/min的转速下离心5min，沉淀在60℃电热真空干燥箱内干燥24h，得到混合物1；

49、（2）将高岭石装入离心管中，取150kg粒径为15目的粉末，加入混合物1，添加325kg30%h2o2溶液，混合均匀，管中产生大量气泡，待气泡消失，得以完全去除含有的有机质，除去有机质后，离心分层，并去除上层清液，继续烘得到得到混合物所述改性纤维。

50、（a）母种制备：

51、母种培养基配方：以重量计，去皮马铃薯100份，葡萄糖13份，琼脂13份，抗杂菌添加剂3份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁2份，水1000份，ph自然。

52、将去皮马铃薯加水煮沸20min至熟而不烂，4层纱布过滤取汁，滤液稀释，然后加所述重量份的葡萄糖、抗杂菌添加剂、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂，待琼脂完全融化后，分装15×150毫米的试管，在0.1兆帕压力下灭菌25分钟，制试管斜面，冷却至室温后在无菌条件下接种0.3cm2的毛木耳原始母种，放置在27℃恒温培养箱中培养14天。

53、（b）原种制备：

54、原种培养基配方：以重量计，棉籽壳75份，麸皮13份，抗杂菌添加剂4份，水257份。

55、棉籽壳暴晒2～3天，粉碎至颗粒状，直径小于6毫米，其中颗粒状直径在4-6毫米占总数量的50％以上；将粉碎的棉籽壳、麸皮、抗杂菌添加剂混合到一起，搅拌均匀让水浸透，将培养料装入750ml菌种瓶，在0.14兆帕下灭菌1.7小时，待菌种瓶冷却后在无菌条件下接入2cm2的母种，放置在27℃培养室中培养21天；

56、（c）栽培种培养基的配制：

57、栽培种培养基配方：以重量计，玉米秸秆200份，改性碱液10份，抗杂菌添加6份，麸皮20份，改性纤维5份，水200份；

58、选择新鲜、无霉变的玉米秸秆，暴晒2～3天，将玉米秸秆切成0.5～0.6cm长，切碎的玉米秸秆用改性碱液浸泡270min，浸泡6h后沥干，拌入其他辅料混合，堆焖2小时，备用；

59、（d）装袋：选用宽、长和厚为16cm×32cm×0.04cm聚丙稀折角塑料袋，将已处理好的栽培培养料装入塑料袋中，栽培培养料重0.98千克，装完后用一直径1.5厘米的木棒在料中央位置从上向下打一洞，用塑料绳扎口；

60、（e）灭菌；高压灭菌在0.14兆帕下保持2.5小时；

61、（f）接种：先使用消毒酒精擦拭手和接种镊子，在菌棒的接种端取出打孔棒，使用镊子将成块的固体菌种接入孔穴，接满整个孔穴，最后使用灭菌的海绵封口；

62、（g）发菌培养：接种后的栽培袋移入培养室培养发菌，发菌期温度控制室温保持在22～38℃，自然湿度即可，在避光的环境中培养，菌丝长满便可得到待栽培的毛木耳菌棒。

63、实施例2：如实施例1所述，所不同的是培养基配方及抗菌添加剂、改性碱液及改性纤维的制备参数：

64、母种培养基配方：以重量计，去皮马铃薯50份，葡萄糖15份，琼脂20份，抗杂菌添加剂2份，磷酸二氢钾4份，硫酸镁1份，水800份，ph自然。

65、原种培养基配方：以重量计，棉籽壳50份，麸皮20份，抗杂菌添加剂3份，水85份。

66、栽培种培养基配方：以重量计，玉米秸秆140份，改性碱液13份，抗杂菌添加5份，麸皮30份，改性纤维4份；

67、抗菌添加剂、改性碱液及改性纤维的制备参数变化见表一。

68、实施例3：如实施例1所述，所不同的是培养基配方及抗菌添加剂、改性碱液及改性纤维的制备参数：

69、母种培养基配方：以重量计，去皮马铃薯150份，葡萄糖10份，琼脂5份，抗杂菌添加剂4份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁3份，水1200份，ph自然。

70、原种培养基配方：以重量计，棉籽壳100份，麸皮5份，抗杂菌添加剂5份，水430份。

71、栽培种培养基配方：以重量计，玉米秸秆260份，改性碱液7份，抗杂菌添加8份，麸皮10份，改性纤维6份；

72、抗菌添加剂、改性碱液及改性纤维的制备参数变化见表一。

73、对比例1

74、本对比例与实施例1的不同之处在于培养基中不添加抗杂菌添加剂，发菌培养过程中，将接种后的栽培袋移入培养室培养发菌，发菌期温度控制室温保持在22～38℃，自然湿度即可，在避光的环境中培养，在接种7天后，检查菌种萌发和污染情况，及时清理未萌发和污染的菌棒，菌丝长满便可得到待栽培的毛木耳菌棒。

75、对比例2

76、本对比例与实施例1的不同之处在于培养基中不添加改性碱液，栽培种培养基制备过程中，切碎的玉米秸秆用15份石灰水浸泡270min，浸泡6h后沥干，拌入其他辅料混合，堆焖2小时，备用。

77、对比例3

78、本对比例与实施例1的不同之处在于培养基中不添加改性纤维。发菌培养过程中，将接种后的栽培袋移入培养室培养发菌，发菌期温度控制室温保持在22～38℃，自然湿度即可，在避光的环境中培养，每天通风30-60min，菌丝长满便可得到待栽培的毛木耳菌棒。

79、对比例4

80、本对比例与实施例1的不同之处在于抗杂菌添加剂中不添加茶树菇，改性碱液中不添加β-环糊精，改性纤维中不添加葵花籽壳。

81、对比例5

82、本对比例与实施例1的不同之处在于抗杂菌添加剂中不添加铁刀木，改性碱液中不添加酒糟，改性纤维中不添加高岭石。

83、对比例6

84、本对比例与实施例1的不同之处在于抗杂菌添加剂中不添加苍耳，改性碱液中不添加碱性离子水。

85、对比例7

86、本对比例与实施例1的不同之处在于抗杂菌添加剂中不添加茶树菇和铁刀木，改性碱液中不添加β-环糊精和酒糟。

87、对比例8

88、本对比例与实施例1的不同之处在于抗杂菌添加剂中不添加茶树菇和苍耳，改性碱液中不添加β-环糊精和碱性离子水。

89、对比例9

90、本对比例与实施例1的不同之处在于抗杂菌添加剂中不添加铁刀木和苍耳，改性碱液中不添加酒糟和碱性离子水。

91、表1

92、

93、备注：表中碱性提取剂组分比是指氢氧化钙：过氧化氢：乙醇：正丁醇的重量百分比。

94、对实施例1～3和对比例制备的毛木耳菌棒进行测试。在菌棒接种7天后，检查菌种萌发和污染情况，记录菌丝长势。

95、菌棒含水量的测定：利用水分测定仪（上海良平仪器仪表有限公司）获取培养料装袋之前的初始含水量，称重装置获取菌棒的初始重量，并按预设时间从放置菌棒的称重装置中获取菌棒实时重量；

96、根据所述初始含水量、所述初始重量和所述菌棒实时重量，确定不同时期的菌棒含水量。

97、

98、其中，θi为菌丝生长第i天的菌棒含水量，wi为菌丝生长第i天的菌棒实时重量，w0为菌棒的初始重量，θ0为初始含水量。

99、日均生长速度：菌丝生长速度(mm/d)=菌落半径(mm)/菌丝生长天数(d)

100、污染烂棒率：每个实施例及对比例制备菌株30棒，在菌棒菌丝生长12d后检查污染情况。污染率（p，%）的计算公式为：

101、p=n/m×100%

102、其中：n为污染的菌棒数量（棒）；m为该菌株栽培菌棒总数量（棒）。

103、表2

104、

105、+表示菌丝稀疏、生长势较弱；++表示菌丝较密、生长势较强；+++表示菌丝浓密、生长旺盛

106、表3

107、

108、结合表1、2、3的数据可知，本发明通过优化茶树菇和铁刀木工艺参数及复配比例，最大程度地促进菌丝对培养基中氮源及钙、镁等所需元素的吸收利用，此外，从实施例1、对比例1、4～9可以看出，苍耳及铁刀木都具有一定的抗杂菌作用，两者以一定的比例复配能最大程度的抑制病原菌的滋生，提高菌棒的抗杂菌能力；本发明利用酒糟热分解物质在高温条件快速分解的特性，通过分解过程中吸收体系的热量，降低相对封闭环境下菌种所处环境的温度，提高了菌棒的耐高温性，从实施例1、对比例2、4～9中可以看出，该工艺下制备的酒糟提取物缓解了高温条件下，菌棒“烧菌”的情况，通过活化β-环糊精和采用碱性离子水真空渗透进一步降低了菌棒的污染烂棒率；实施例1、对比例3、4、5中可以看出，本发明通过工艺改进使得葵花籽中α-纤维素和半纤维素与高岭石中矿物相结合，最终提取物具有的水分吸附能力，能满足毛木耳菌丝生长阶段对空气湿度的要求，将体系的湿度控制在菌丝最适生长范围内，实现对环境湿度的稳定调节。