一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法

本发明涉及生物，具体为生物材料/组织冷冻保存领域，尤其是鱼类胚胎冷冻保存。

背景技术：

1、由于鱼胚体积大(直径为≥1mm)、双层膜结构、绒毛膜通透性差、卵黄囊含水量多等特点,其冷冻保存比哺乳类胚胎困难许多。到目前为止,只有极少数品种的鱼胚能够成功冷冻保存。对于鱼类胚胎等大体积的生物样本，冷冻保存的方法通常只能采用玻璃化法，玻璃化法是一种利用较高的抗冻剂浓度与极快的降温速率，使溶液达到无冰晶的玻璃化状态，从而减少生物样品受到的机械损伤的一种方法。该方法因其简便、快速、低成本以及更好地保护胚胎避免受到冷冻带来的细胞损伤已被广泛采用。zhang等人使用含有丙二醇、甲醇、甘油、蔗糖的冷冻保护剂对石斑鱼胚胎进行了超低温保存的初步研究,得到了6.32％的存活率，存活胚胎中有39.85％最终孵化成功。丁等人采用程序降温方法和玻璃化方法对真鲷胚胎冷冻进行保存，取得液氮区胚胎冷冻复活的突破性进展,然后通过检测胚胎存活率，得到结果丙二醇对真鲷胚胎的毒性最低，毒性最高的为甲醇。

2、中国水产科学研究院黄海水产研究所的陈松林和田永胜教授曾发表关于海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法。方案如下：鱼类胚胎收集：选用出膜前期的胚胎；玻璃化液配制：是基础液和抗冻剂的混合液，基础液(bs2)为：nacl 2.472％、kcl 0.086％、cacl2·2h2o0.146％、mgcl2·6h2o 0.486％、nahco3 0.019％；抗冻剂为：1，2-丙二醇(pg)、甲醇(meoh)；玻璃化液配方是：bs2：50-67％，pg：20-30％，meoh：13-20％；胚胎冷冻前的平衡处理：将胚胎逐级依次在浓度为25％、33％、50％、67％及100％的玻璃化液中分五次进行平衡处理，处理45-55min，每步9-11min；液氮中速冻保存：将平衡好的胚胎9-13粒连同250ul的玻璃化液吸入到直径3mm、长10cm麦管内，热压封口后，以2000℃/min的降温速率投入到-196℃液氮中速冻保存；解冻和培育：将麦管从液氮中移出，在1-2秒内快速插入39-40℃水浴中使其迅速解冻，在胚胎乳白色即将消失时，剪开麦管，用2ml 0.125m的蔗糖洗脱液，将胚胎冲入器皿中进行洗脱，时间为10min，之后添加14-16℃灭菌海水进行培育。

3、由于现有技术缺少针对淡水经济鱼类蒙古鲌胚胎的冷冻保存技术；同时，现有技术采用0.25ml麦管保存鱼类胚胎，保存方式粗糙，降温升温无法做到均匀稳定，保存效果不佳。另外，现有技术无法完全避免玻璃化溶液复温过程中的重结晶现象，实验结果存在偶然性，可重复性较差。

技术实现思路

1、针对现有技术缺乏针对淡水经济鱼类蒙古鲌的胚胎的冷冻保存技术的问题，本发明提供一种蒙古鲌胚胎冷冻保存液试剂盒及冷冻保存方法，以克服现有技术的不足。

2、一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法，包括如下步骤：

3、(1)蒙古鲌胚胎先后在平衡液一es1和平衡液二es2中，分别平衡8-12min；

4、将冷冻保护剂与稀释液按1：1.8-2.4体积比混合配制平衡液一；将冷冻保护剂与稀释液按1.8-2.4:1体积比混合配制平衡液二；

5、所述稀释液以水作为溶剂，含有6-10g/l氯化钠、0.3-0.7g/l氯化钾、12-18g/l葡萄糖；

6、所述冷冻保护剂以水为溶剂，含有体积分数8％-15％甲醇、体积分数10％-20％丙二醇、体积分数10％-20％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/l氯化钠、0.2-0.4g/l氯化钾、7-11g/l葡萄糖、0.5-1.5mmol/l褪黑素和0.5-1.5mg/l fe3o4磁性纳米微球；

7、(2)蒙古鲌胚胎转移至冷冻保护剂cpa中，收集单个蒙古鲌胚胎，置于液氮冷却的金属块上8-12s，放于冻存容器内并封口，保存于液氮中。

8、优选的，所述的蒙古鲌胚胎处于尾芽期。

9、fe3o4磁性纳米微球粒径为100-800nm，优选的，fe3o4磁性纳米微球粒径为500-600nm。

10、优选的，可以用上述稀释液为溶剂，加入甲醇、丙二醇、二甲基亚砜、褪黑素和fe3o4磁性纳米微球配制冷冻保护剂，其中稀释液的体积分数为50％-70％。

11、优选的，所述稀释液含有7-9g/l氯化钠、0.4-0.6g/l氯化钾、14-16g/l葡萄糖。所述冷冻保护剂含有体积分数9％-12％甲醇、体积分数12％-16％丙二醇、体积分数12％-16％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/l氯化钠、0.2-0.4g/l氯化钾、8-10g/l葡萄糖、0.8-1.2mmol/l褪黑素和0.8-1.2mg/l fe3o4磁性纳米微球。

12、优选的，步骤(1)中，所述平衡液一由冷冻保护剂与稀释液按1：2体积比混合而成；所述平衡液二由冷冻保护剂与稀释液按2:1体积比混合而成。

13、在本发明的一个优选方式中，所述的稀释液以水作为溶剂，含有8g/l氯化钠、0.5g/l氯化钾和15g/l葡萄糖。

14、所述的冷冻保护剂含有体积分数15％二甲基亚砜、体积分数10％甲醇、体积分数15％丙二醇、1mmol/l褪黑素和1mg/l fe3o4磁性纳米微球；且其中氯化钠含量4.8g/l，氯化钾含量3g/l，葡萄糖含量9g/l。冷冻保护剂可以用体积分数为60％的稀释液为溶剂，加入甲醇、丙二醇、二甲基亚砜、褪黑素和fe3o4磁性纳米微球配制为冷冻保护剂。

15、步骤(2)中，优选的，使用冷冻钩收集单个蒙古鲌胚胎；所述的冻存容器优选为冷冻环套。收集的蒙古鲌胚胎放在置于液氮冷冻中的金属块上，降温10s，插到已放置在液氮上进行冷冻的冷冻环套中，热机封口，放入液氮罐速冻保存；以液滴的形式保存单个胚胎。金属块可以选用铝合金金属块。

16、本发明提供了一种蒙古鲌胚胎冷冻保存试剂，包括稀释液和冷冻保护剂中的至少一种。

17、所述稀释液以水作为溶剂，含有6-10g/l氯化钠、0.3-0.7g/l氯化钾、12-18g/l葡萄糖；

18、所述冷冻保护剂含有体积分数8％-15％甲醇、体积分数10％-20％丙二醇、体积分数10％-20％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/l氯化钠、0.2-0.4g/l氯化钾、7-11g/l葡萄糖、0.5-1.5mmol/l褪黑素和0.5-1.5mg/l fe3o4磁性纳米微球。冷冻保护剂可以用上述稀释液配制，其体积分数为50％-70％。fe3o4磁性纳米微球粒径为100-800nm，优选的，fe3o4磁性纳米微球粒径为500-600nm。

19、优选的，所述稀释液含有7-9g/l氯化钠、0.4-0.6g/l氯化钾、14-16g/l葡萄糖。所述冷冻保护剂含有体积分数9％-12％甲醇、体积分数12％-16％丙二醇、体积分数12％-16％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/l氯化钠、0.2-0.4g/l氯化钾、8-10g/l葡萄糖、0.8-1.2mmol/l褪黑素和0.8-1.2mg/l fe3o4磁性纳米微球。冷冻保护剂可以用体积分数为56％-65％的稀释液配制。

20、作为优选，所述稀释液以水作为溶剂，含有8g/l氯化钠、0.5g/l氯化钾和15g/l葡萄糖。所述冷冻保护液以上述稀释液为溶剂，其体积分数为60％，加入甲醇、丙二醇、二甲基亚砜、褪黑素和fe3o4磁性纳米微球配制，含有体积分数15％二甲基亚砜、体积分数10％甲醇、体积分数10％丙二醇、1mmol/l褪黑素和0.001mg/ml fe3o4磁性纳米微球；其中氯化钠含量为4.8g/l，氯化钾含量为3g/l，葡萄糖含量为9g/l。

21、使用时可以将稀释液和冷冻保护剂混合，分别配置平衡液一和平衡液二。

22、将稀释液和冷冻保护剂cpa按1.8-2.4：1体积比混合，可以配制平衡液一，

23、优选的，稀释液和冷冻保护剂cpa按2：1体积比混合，配制平衡液一。

24、将稀释液和冷冻保护剂cpa按1：2体积比混合，可以配制平衡液二；

25、优选的，稀释液和冷冻保护剂cpa按1：2体积比混合，配制平衡液二。

26、上述方法对蒙古鲌胚胎进行冷冻保存后，进行解冻的方法为：冷冻的蒙古鲌胚胎依次置于0.4-0.6mol/l和0.15-0.35mol/l蔗糖溶液中，室温平衡8-12min，最后转移至上述稀释液中。

27、优选的，冷冻的蒙古鲌胚胎依次置于0.45-0.55mol/l和0.2-0.3mol/l蔗糖溶液中，室温平衡9-11min。

28、在本发明的一个优选方式中，冷冻的蒙古鲌胚胎依次置于0.5mol/l和0.25mol/l蔗糖溶液中，室温平衡时间均为10min。

29、本发明的有益效果在于：

30、本发明提供了一种蒙古鲌胚胎冷冻保存方法，采用多种溶剂和抗氧化剂褪黑素混合的冷冻保存液配方，降低了单一有机溶剂的毒性，减少了细胞受到的毒性损伤和在冷冻保存过程重点氧化损伤，提高了冷冻保存的效果，胚胎孵化率达到19.57％。

31、本发明在冷冻保护剂中添加fe3o4纳米材料，提高了溶液的导热性能，增加了升降温速率，改善了复温过程中的重结晶现象。

32、本发明采用固体表面玻璃化法，以液滴的形式保存单个胚胎，流程更加精细化，确保每颗胚胎的升降温过程都能做到温度变化均一，提高保存效果和保存方案的可重复性。