用于构建小鼠肝癌原位移植模型的试剂盒

本发明属于临床医学领域，具体涉及一种用于构建小鼠肝癌原位移植模型的试剂盒及其应用、以及所构建小鼠肝癌原位移植模型在中的用途。

背景技术：

1、肝癌是严重威胁人类生命健康的主要恶性肿瘤之一，肝癌的研究始终是医学研究领域热点。小鼠肝癌模型为研究肝癌的发生、发展、治疗等基础及临床研究提供了有效的途径。目前肝癌小鼠模型主要有皮下肝癌模型，小鼠原位模型等。然而，小鼠肝癌原位模型是目前研究肝癌生长、侵袭和转移机制不可或缺的主要工具之一。肝癌原位模型不仅维持了原有肿瘤特征，而且保持肝脏原有血供，准确解剖位置，为研究肝癌生物学性状及实验干预提供了精确的动物模型基础。原位小鼠模型分为致癌物诱发性、移植性、基因编辑性小鼠等肝癌模型。然而，致癌物诱发性小鼠模型存在化学毒性，难以把控计量及周期较长等缺点；基因编辑性小鼠成本较高，技术实现难，在实验中较少采用。肝原位移植模型建模周期较短，成功率较高，现广泛采用。但，肝癌原位移植模型由于实施难度大，时间长，动物需麻醉、苏醒，操作繁琐。对术者、实验环境、人员技术要求较高，仅为少数实验室采用。目前广泛采用的肝癌原位移植模型的瘤体一般为人源性肝癌手术标本、鼠源性标本移植。以鼠源性肿瘤样本应用为主。但是，原位移植模型存在瘤体固定难，手术失血多，时间长等问题。

2、已经有不少报道改进小鼠肝癌原位移植模型构建方法，例如专利文献cn112262815a公开了一种小鼠原位移植性肝癌模型的制备方法，小鼠麻醉后上腹正中切口入腹，无损伤止血钳行第一肝门阻断，于肝左叶以301/2号弯针头注入肝癌细胞0.05ml，电凝笔凝固针眼，无活动性出血后松解肝门阻断钳，关腹。该方法克服了由于血流导致的肿瘤细胞流出、不局限种植、成瘤率低等缺陷，并减少了针眼出血过多导致的失血性休克死亡和肿瘤的腹腔种植。cn113875689a公开了一种裸小鼠肝癌原位移植模型的建立方法，将皮下移植瘤模型制备好的实体瘤切成大小约为2mm×2mm×1mm的肿瘤组织块备用，然后将裸小鼠进行麻醉，取仰卧位，皮肤消毒，剑突下方约5～10mm沿腹中线向动物的右侧横向开腹，开口长度约为1cm，暴露出肝脏，使用“夹心法”将肿瘤组织取出，其中“夹心法”是用手术线将肿瘤组织块直接缝在肝右叶内侧:先用带缝合线的缝合针穿过肿瘤组织，再从肝右叶内侧穿至外侧，然后打一个手术结，轻轻拉紧，剪断手术线。该方法具有实验过程出血少、对动物伤害小、操作时间短、难度低等优势。

3、这些现有技术的方案中一般都有手术缝线固定、生物胶固定操作程序等。但是，由于术中手术缝线与肝脏颜色接近，缝合难度大，耗时长，需具有丰富经验术者；再者，肝被膜较薄，存在肝实质被缝线拉扯导致缝合失败等缺点。生物胶为有机物，固定瘤体法存在异体物质的干扰，其生物胶即在使用的过程中，要保持创面干燥，要尽量均匀、缓慢，否则易形成大的结块，容易与周围脏器粘连、术后解剖位置及肿瘤观察较为困难等缺点。

技术实现思路

1、鉴于小鼠肝癌原位移植模型具有重要的临床研究价值，发明人为了克服现有技术存在的上述不足之处，通过多次试验，提供了一种构建小鼠肝癌原位移植模型的新方法，使得建模操作更为简便，减少了动物痛苦，成功率反而能显著提高，大幅度节约科研成本。具体地，本发明包括如下技术方案。

2、一种用于构建小鼠肝癌原位移植模型的试剂盒，其特征在于，包括：h22细胞株；生化试剂，包括1640培养基、fbs(胎牛血清)、p/s(青霉素/链霉素混合溶液，即p/s双抗)、pbs(平衡盐溶液pbs，磷酸盐平衡生理盐水)、d-luciferin potassium salt(d-荧光素钾盐)例如xenolight d-luciferin potassium salt(perkinelmer)、基质胶；实验器材，包括细胞培养瓶、离心管；手术器械，包括手术剪、缝合针带线、“o”型环。

3、优选地，上述h22细胞株是h22-luc细胞(h22-luc，小鼠肝癌细胞-荧光素酶标记)。

4、在一种实施方式中，上述h22细胞株的培养及使用条件可以为：h22-luc细胞加入完全培养基(1640培养基89％、fbs10％、p/s1％)中重悬，置于37℃、5％co2浓度的二氧化碳培养箱中培养24h，待培养细胞在对数生长期时(培养基颜色由红色转为深黄色时)，细胞密度达到80-100％，进行1:2或1:3传代培养，收集培养液，离心，弃去上清，pbs洗涤2次后用pbs重悬，调整细胞浓度为大约2×107/ml，每只小鼠注射0.1ml。

5、上述小鼠可以选用balb/c小鼠。

6、上述“o”型环是内径大约为5mm的塑料“o”型环，用于覆盖在埋入小鼠肝脏的切口上方，供基质胶加入直至完全凝固，限定加入的基质胶的流动范围，然后被移除。

7、例如“o”型环可以选自下组：①东台市鹏凯有限公司，货号7*1；②圆盟实业(深圳)有限公司，货号7*1；③温州纳智紧固件有限公司，货号7*1。

8、上述基质胶是动物模型构建中常用的基质胶，可以选自下组：①康宁公司，货号356234/354234；②碧云天有限公司，货号c0386/c0387。

9、上述缝合针带线是临床手术和动物模型构建中常用的缝合针带线(0#5)，可以选自下组：①宁波灵桥有限公司，货号0#5；②美国强生有限公司，货号w580；③上海浦东金环有限公司，货号0#5。

10、优选地，上述手术器械还包括眼科镊(包括弯镊、直镊)、持针钳、棉签等。

11、上述试剂盒还可以包括：碘伏、75％酒精、庆大霉素。

12、可选地，上述试剂盒还可以包括：麻醉剂，用于对小鼠实施麻醉，选自异氟烷或者戊巴比妥钠。麻醉剂可根据麻醉师的建议配置。

13、当麻醉剂是戊巴比妥钠麻醉时，戊巴比妥钠剂量大约为30-50mg/kg小鼠体重，例如大约50mg/kg小鼠体重。

14、当麻醉剂是异氟烷气体时，麻醉剂的施用是采用小动物麻醉机比如matrx vip3000型气体麻醉机对小鼠实施麻醉，小鼠进行异氟烷气体吸入麻醉时，具体操作过程中按小鼠具体情况调整给予麻醉药的流量。

15、为减少造模失败概率，上述的试剂盒不包括液体生物胶，以免操作人员将其误用作流动性小的基质胶，导致流动性强的生物胶误粘连肝脏周围其他脏器组织，不利于小鼠切口愈合，阻碍肿瘤生长。

16、进一步地，为减少造模失败概率，上试剂盒也不包括手术缝线，以免操作人员误将其误当作缝合针带线(0#5)缝线使用，因为手术缝线与肝脏颜色接近，缝合难度大，耗时长，操作技术要求高，存在肝实质被缝线拉扯导致缝合失败风险。

17、本发明第二个方面提供了上述试剂盒在构建小鼠肝癌原位移植模型中的用途。

18、作为一种上述试剂盒的具体使用方式，通过包括下述步骤的方法实施小鼠肝癌原位移植模型构建：

19、1)培养h22细胞，将h22-luc细胞加入完全培养基中重悬，所述完全培养基组成为：1640培养基89％、fbs10％、p/s1％；置于37℃、5％co2浓度的二氧化碳培养箱中培养24h左右，待培养细胞在对数生长期时(培养基颜色由红色转为深黄色时)，细胞密度达到80-100％，进行1:2或1:3传代培养；

20、2)收集h22细胞培养液，离心，弃去上清，pbs洗涤2次后用pbs重悬，调整细胞浓度为大约2×107/ml，对小鼠进行皮下注射细胞；

21、3)1周后，待小鼠的皮下模型形成，麻醉，剃毛、碘伏消毒，切开表皮，取出皮下瘤，分离肿瘤包膜，暴露肿瘤实质，将瘤体浸泡pbs液中，用眼科镊修剪成小肿瘤组织块；

22、4)将受体小鼠(另一只小鼠)剃毛、麻醉、碘伏消毒，切开表皮、腹膜、剪开肝被膜，扩大手术视野，后用沾有pbs的棉签将肝脏脱出体外，用眼科弯剪将肝脏被膜小心剪开，逐步形成3mm隧道，用干棉签压迫止血，将肿瘤组织块埋入肝脏隧道中；

23、5)将“o”型环覆盖在埋入肝脏的切口上方，加入基质胶，等基质胶完全凝固后，用眼科镊小心移除“o”型环；待基质胶凝固、未出血后，用缝合针带线(0#5缝线)分层关腹，切口消毒，注射庆大霉素，小鼠保温，等待麻醉苏醒；

24、6)每周进行腹腔注射d-luciferin potassium salt(15mg/ml)，动物ivis iv系统活体成像后期，观察肿瘤的生长情况，确认小鼠肝癌原位移植模型构建完成。

25、优选上述小鼠是balb/c小鼠。

26、应理解，本文中在表述数值特征时，术语“约”或者“大约”是指所表示的本数可以有±10％、±8％、±6％、±4％或±2％的误差范围或浮动范围。

27、本发明提供了新颖的小鼠原位肝癌移植标记模型构建工具和方法，可以用于小鼠原位肝癌移植模型的建立及肝癌小鼠动物后续实验。相对于现有技术而言，简化了肝癌原位移植模型建模的操作步骤，缩短了手术时间，减少动物痛苦，不仅提高实验工作效率，还增加了成功率，能够大幅度降低小鼠肝癌原位移植模型的生产成本，具有经济意义。