一种干燥保护剂及间充质干细胞的细胞干燥工艺的制作方法

本技术涉及干细胞，具体涉及一种干燥保护剂及间充质干细胞的细胞干燥工艺。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)是一种存在于多种组织器官(如骨髓、脂肪、脐带、皮肤、牙髓等)中的多能干细胞，具有多向分化的潜能，能够定向分化成脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞等，因此，间充质干细胞可以广泛应用于多种疾病的治疗和组织工程研究。此外，间充质干细胞的性能稳定、输注方便、便于运输，因此在新医疗领域具有重大的应用价值。

2、近年来，为了使间充质干细胞在常温下能获得更长的保存时间，研究人员通常是将间充质干细胞在低温、真空条件下冻干制成冻干粉进行保存，从而使间充质干细胞在长时间内保持其原有的生物活性，获得更长的保存时间。然而，上述冷冻干燥工艺存在一定的缺陷，比如冷冻干燥过程容易损伤细胞，造成细胞活性下降、甚至失活。因此，如何降低冷冻干燥对间充质干细胞的损伤，使细胞保持高活性是目前急需解决的问题。

技术实现思路

1、为了降低冷冻干燥对间充质干细胞的损伤，提高间充质干细胞的存活率，本技术提供一种干燥保护剂及间充质干细胞的细胞干燥工艺。

2、第一方面，本技术提供一种干燥保护剂，采用如下的技术方案：

3、一种干燥保护剂，所述干燥保护剂包括以下含量的组分：egcg：5-45mg/100ml、羟基四氢嘧啶：300-520mg/100ml、维生素c：350-500mg/100ml、依达拉奉：0.02-0.3mg/100ml、槲皮苷：0.10-0.35mg/100ml、天门冬氨酸：180-280mg/100ml、四氢嘧啶：400-500mg/100ml、海藻糖：10-60g/100ml、右旋糖酐：20-50g/100ml、麦芽糖：25-40g/100ml和2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖：30-60mg/100ml，溶剂为磷酸盐缓冲液pbs。

4、本技术提供了一种干燥保护剂，将该干燥保护剂加入至间充质干细胞中，干燥保护剂中的各有效成分能够加载至细胞内部，从而在间充质干细胞的后续(冷冻)干燥过程中起到很好的稳定和保护作用，有效避免间充质干细胞发生形态变异及损伤，从而提高间充质干细胞的冷冻干燥后的存活率。

5、本技术中，egcg(表没食子儿茶素没食子酸酯)是茶多酚的有效活性成分，具有抗氧化的作用，本技术将egcg加入到干燥保护剂中，能够保证间充质干细胞中的热敏成分及易氧化成分在干燥过程不被损伤，从而有效提高间充质干细胞的存活率。羟基四氢嘧啶是一种优良的相容性溶质，能够用于稳定细胞，尤其是在冻融循环过程中可以起到很好的细胞保护作用，进而减少细胞损伤，使细胞始终保持其自身活性。维生素c能够保持细胞的完整性，而且还具有一定的抗自由基、抗氧化作用。依达拉奉可以有效清除体系中的自由基，抑制间充质干细胞氧化损伤，进而提高间充质干细胞的存活率。槲皮苷能够清除多种活性氧自由基，有很好的抗氧化作用。天门冬氨酸是一种α-氨基酸，它可作为k+、mg2+离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌起到保护作用；本技术通过研究发现，向干燥保护剂中加入天门冬氨酸，能够有效避免间充质干细胞内的蛋白质变性失活，对间充质干细胞起到很好的保护作用，海藻糖是由两个葡萄糖分子以a，a，1，1-糖苷键构成非还原性糖，其在冷冻、干燥失水等恶劣环境条件下，能在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不发生变性失活，从而维持细胞的活性。右旋糖酐能够改善细胞悬液的粘稠度，减少细胞聚集；而且右旋糖酐能够粘附在细胞的表面，对细胞起到覆盖与保护作用。麦芽糖中含有大量的碳水化合物，能够调节维持细胞活性。2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖是葡萄糖的衍生物，具有很好的水溶性、抗氧化性与生物相容性，本技术将2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖加入至干燥保护剂中，能够减少细胞干燥过程中热敏成分与易氧化成分的损伤，提高间充质干细胞的存活率。

6、在一个具体的实施方案中，所述天门冬氨酸的含量可以为180mg/100ml、ml200mg/100ml、230mg/100ml、260mg/100ml或280mg/100ml。

7、在一个具体的实施方案中，所述2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖的含量可以为30mg/100ml、40mg/100ml、50mg/100ml或60mg/100ml。

8、优选地，所述干燥保护剂包括以下含量的组分：egcg：5-45mg/100ml、羟基四氢嘧啶：300-520mg/100ml、维生素c：350-500mg/100ml、依达拉奉：0.02-0.3mg/100ml、槲皮苷：0.10-0.35mg/100ml、天门冬氨酸：200-260mg/100ml、四氢嘧啶：400-500mg/100ml、海藻糖：10-60g/100ml、右旋糖酐：20-50g/100ml、麦芽糖：25-40g/100ml和2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖：40-60mg/100ml，溶剂为磷酸盐缓冲液pbs。

9、进一步优选地，所述干燥保护剂包括以下含量的组分：egcg：37mg/100ml、羟基四氢嘧啶：465mg/100ml、维生素c：480mg/100ml、依达拉奉：0.20mg/100ml、槲皮苷：0.23mg/100ml、天门冬氨酸：230mg/100ml、四氢嘧啶：465mg/100ml、海藻糖：58g/100ml、右旋糖酐：32g/100ml、麦芽糖：32g/100ml和2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖：50mg/100ml，溶剂为磷酸盐缓冲液pbs。

10、第二方面，本技术提供一种间充质干细胞的细胞干燥工艺。

11、一种间充质干细胞的细胞干燥工艺，该细胞干燥工艺采用了前述干燥保护剂。

12、优选地，所述细胞干燥工艺包括以下步骤：冷热循环处理、干燥；

13、所述冷热循环处理为：向间充质干细胞中加入干燥保护剂，然后进行冷热循环；冷热循环的条件为：39±2℃下保存5-20min，然后在4±2℃下保存5-20min；重复上述操作2-8次，获得细胞悬液。

14、本技术中，首先向间充质干细胞中加入干燥保护剂，然后通过冷热循环处理的方式使得干燥保护剂中的组分充分加载至细胞内部，使干燥保护剂在后续(冷冻)干燥过程中能够充分发挥作用。

15、本技术中，所述干燥可以为真空干燥；真空干燥的温度为28-35℃；真空干燥的真空程序为：首先在600-700pa保持10-20min，然后在100-120pa保持55-80min。

16、在一个具体的实施方案中，所述真空干燥的温度可以为28℃、30℃或35℃。

17、本技术中，所述干燥还可以为真空冷冻干燥，具体为：首先将冷热循环处理后的细胞冷冻；然后将冷冻细胞在真空度为1-3pa、隔板温度为-(30-50)℃的条件下进行一次冻干，时间为15-24h；然后将隔板温度升高至10-20℃保持5-15h。

18、本技术中，真空干燥或真空冷冻干燥均可以实现间充质干细胞的干燥，上述干燥工艺获得的干细胞经复水后，细胞存活率均可以达到80％以上。

19、本技术中，所述细胞冷冻的条件为：2-6℃下预冷10-20min，然后在-(75-85)℃下冷冻50-70min。

20、优选地，所述隔板温度的升温速率为0.21-2.0℃/min。

21、在一个具体的实施方案中，所述隔板温度的升温速率可以为1.5℃/min。

22、第三方面，本技术提供一种利用所述细胞干燥工艺干燥获得的细胞。

23、第四方面，本技术提供一种复水方法，包括以下步骤：将复水液加入至间充质干细胞中，直至细胞溶解；所述复水液是体积比为(2-4)：1的pbs缓冲液和蒸馏水。

24、在一个具体的实施方案中，所述复水液是体积比为3：1的pbs缓冲液和蒸馏水。

25、综上所述，本技术具有以下有益效果：

26、1.本技术提供一种利用egcg、羟基四氢嘧啶、维生素c、天门冬氨酸和2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖等制成的干燥保护剂，该干燥保护剂能够在间充质干细胞(冷冻)干燥过程中起到很好的稳定和保护作用，有效避免间充质干细胞发生形态变异及损伤，从而有效提高间充质干细胞的冷冻干燥后的存活率。

27、2.本技术进一步将天门冬氨酸的含量控制在200-260mg/100ml范围内，将2,3,4,6-四乙酰-d-葡萄糖的含量控制在40-60mg/100ml范围内，获得的干燥保护剂能够显著降低干燥过程对间充质干细胞的影响，提高间充质干细胞的存活率至90％以上。

28、3.本技术进一步将干燥过程的隔板温度控制在28-35℃之间，能够有效避免间充质干细胞发生变异，使间充质干细胞在干燥及复水后，存活率达到95％以上。

29、4.本技术在间充质干细胞的冷冻干燥工艺中，对间充质干细胞先进行预冷，能够给予细胞一定的缓冲时间，使得细胞内的残余水分在冻结之前透出细胞外，进一步降低冰晶对细胞的损伤，从而提高细胞存活率。